猪肺炎支原体（M.hyopneumoniae，Mhy）

猪肺炎支原体（M.hyopneumoniae，Mhy）

猪肺炎支原体自然感染仅见于猪，以哺乳仔猪和幼猪最易感，临床表现为咳嗽和气喘，发病率高，死亡率低。

1.形态染色

形态多样，Mhy 液体培养物涂片瑞氏染色镜检，可见到以点状、环形为主，也见球状、两极杆状、丝状、新月状，多见单个菌体，也有几个在一起似长丝串联而成（图10-1-1），可通过0.2µm 孔径滤膜。

2.培养特性

兼性厌氧。对营养要求苛刻，一般培养基很难生长。目前常用培养基有ATCC 培养基、改良支原体培养基、1699 Revised Mycoplasma Medium、A26 培养基等。将病料接种到1～2ml的液体培养基的试管或青霉素瓶中（需胶塞），37℃、静止或振荡密闭培养。Mhy 在培养过程中能发酵培养基中的葡萄糖产酸而使pH 发生变化，通过酚红指示剂可以观察到培养基颜色的变化。在液体培养基中初次分离生长缓慢，需培养3～30 天，一般接种后3～7 天可以使培养基的pH 从7.6 变为6.8，颜色由红变黄。支原体在液体培养基中生长量较少，生长后培养基清亮，有的产生浅淡的均匀混浊，观察时须与空白对照管比较。在传代过程中需每天观察pH 变化，pH 到6.8，培养基颜色由红变黄要及时处理，或继续传代，pH 到6.7 以下，Mhy 不适宜生长。将产酸的培养物重新接种于新鲜液体培养基中，多次接种，如果培养1～2天培养基的pH 降至约6.8，表明支原体已适应生长。通常将适应在液体培养基上生长的培养物接种到固体培养基上，在5%～10% CO2的潮湿培养箱中，经37℃培养5 天左右发现细小菌落，需在低倍显微镜或体视显微镜下观察，典型菌落为圆形、边缘整齐、灰白色、半透明、中间凸起的乳头状菌落，表面有许多小颗粒，菌落直径100～300µm，不呈“荷包蛋状”。

3.生化特性

详见表11-1-2。

4.分离鉴定

（1）分离培养时，取病肺组织剪成1～2mm 的碎块放入液体培养基中培养，或将采集的呼吸道分泌物棉拭子置液体培养基中，液体培养基过滤器除菌后置37℃培养，进行4～5代连续移植以提高分离率。当液体培养物出现疑似菌体时，应适当稀释接种于固体培养基，在5%～10% CO2环境置37℃培养3～10 天，逐日观察有无菌落。

从病肺组织常分离出猪鼻支原体，因其易于培养且生长迅速，常在培养基中加入抗猪鼻支原体兔血清或加入有选择抑制作用的抗生素（环丝氨酸或庆大霉素），以提高Mhy 的分离率。(https://www.daowen.com)

（2）PCR 检测

① 模板制备：取1mlMhy 菌液或待检支气管肺泡灌洗液于离心管中，12 000r/min 离心30min，弃上清，沉淀用无菌去离子水重悬；100℃水浴10min 后10 000r/min 离心10min；收集上清，即为PCR 模板，-20℃保存备用。

② 引物序列：

P1：5′-TTA GTG TCT CCC GTT ATG-3′

P2：5′-GAA ATC CGT ATT CTC CTC-3′

P3：5′-TTA CAG CGG GAA GAC C-3′

P4：5′-CGG CGA GAA ACT GGA TA-3′

③ 第1 次PCR 扩 增 体 系：premix 12.5µl，ddH2O 7.1µl，P1 和P2 引 物 各0.2µl，模 板5µl。扩增条件：95℃预热5min；95℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 1min，扩增34 个循环；72℃延伸8min。扩增长度为621bp。

④ 套式PCR 扩增体系：premix 12.5µl，ddH2O 11.1µl，P3 和P4 引物各 0.2µl，模板为第一次扩增产物1µl。扩增条件：95℃预热5min；95℃30s，51℃30s，72℃30s，扩增34 个循环；72℃延伸8min。扩增长度为427bp。