绞股蓝皂苷减轻缺氧性脑损伤的实验研究
绞股蓝皂苷具有多种生理活性，包括免疫调节、抗缺血、降血脂、保肝等作用以及显著的抗氧化作用，其对低氧性脑损伤的影响及作用机理尚未见报道。我们基于体外的PC12细胞模型和模拟高原低氧暴露小鼠展开了一系列研究。
1.绞股蓝皂苷对细胞模型的抗缺氧活性研究
神经样高度分化的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞是一种来源于大鼠肾上腺髓质的无性系细胞，由于其神经元的特性，广泛应用于神经发育和神经疾病的细胞模型。CCK8检测结果显示，常氧条件下，绞股蓝皂苷对PC12细胞表现出轻微促进细胞生长的作用。但细胞经缺氧（氧浓度为0.1%）处理24 h后，细胞活力显著降低，仅为对照组的49.52%。但经不同剂量活性组分绞股蓝皂苷（0.03 mg/mL、0.1 mg/mL、0.3 mg/mL）预处理6 h后再经缺氧损伤处理，PC12细胞活力有所提升，尤其是在0.1 mg/mL和0.3 mg/mL的高剂量下，能显著逆转缺氧条件下细胞活力下降的状态（图8.2）。这些研究表明，在体外的神经元缺氧模型中，绞股蓝皂苷具有保护PC12细胞耐受缺氧损伤的药理活性。
图8.2 绞股蓝皂苷对缺氧条件下的PC12细胞活力的影响
2.绞股蓝皂苷对动物模型的抗缺氧活性研究
以成年雄性C57BL/6成年小鼠为研究对象，利用大型低压低氧动物实验舱模拟海拔8000m的高原缺氧环境，建立急性缺氧模型，灌胃给药，考察活性组分绞股蓝皂苷对模型小鼠的脑组织病理显微结构的改变。海马组织在记忆功能中起着关键作用，是大脑中特别容易受到缺氧损伤的区域之一。尼氏体是神经细胞的特征性结构之一，与神经元的功能极为密切，神经元受损害发生变化时，尼氏体的数量、位置、排列方式等也会随之发生变化，尼氏体的变化是可逆的，去除病因后，尼氏体可恢复正常。因此，可将尼氏体形态的变化作为反应神经元是否受损的重要指标。
通过尼氏染色技术，评价给药前后模型小鼠海马组织中神经元形态的变化，结果如图8.3所示，正常组小鼠海马组织中各分区（CA1、CA3、DG）的细胞结构完整，排列整齐，染色均一。药物处理组小鼠的神经元的结构形态与对照组相似。高原缺氧处理组中，CA1和CA3区神经元结构形态与对照组分布相似，但DG区的神经元细胞排列松散、混乱，细胞数量明显减少，以及出现部分神经元核固缩的情况。经绞股蓝皂苷预处理两周再经高原缺氧处理的小鼠中，我们观察到各分区的细胞结构形态又回归正常，缺氧损伤受到抑制。表明绞股蓝皂苷对急性高原缺氧造成的海马组织神经元损伤具有显著的保护活性。
图8.3 海马组织以及CA1、CA2和DG区的尼氏染色图
3.绞股蓝皂苷抗缺氧作用机制研究
文献报道，缺氧状态下的神经元损伤和认知障碍与细胞外调节蛋白激酶（ERK）、蛋白激酶B（Akt）、环AMP反应元件结合蛋白（CREB）和脑源性神经营养因子（BDNF）有关。缺氧可改变ERK/CREB的表达，导致学习记忆障碍，可下调BDNF水平，引起树突萎缩和神经退行性病变，导致学习和记忆缺陷。此外，磷酸化的CREB还可作为转录因子增加BDNF的表达，进而增强海马区域的记忆功能。Akt作为许多神经保护信号级联的关键激酶之一，是促进细胞存活的重要通路，在缺氧预处理过程中可被激活。
在高原缺氧小鼠模型中，借助Western blot技术和RT-PCR技术评价了活性组分绞股蓝皂苷对小鼠海马体中信号通路的调节作用和BDNF基因表达水平的影响，发现绞股蓝活性部位绞股蓝皂苷可有效激活Akt、ERK和CREB信号通路并逆转BDNF相关mRNA表达水平的下降趋势（图8.4）。这些研究表明，绞股蓝活性部位绞股蓝皂苷对高原缺氧所致脑损伤的保护作用可能是通过激活ERK、Akt、CREB和BDNF通路来实现的，为深入地开展药理作用机制研究奠定了基础。上述研究显示，活性组分绞股蓝皂苷可以激活CREB/BDNF信号通路，表明绞股蓝皂苷在预防认知功能障碍方面具有巨大的应用潜能。
4.新型达玛烷型三萜皂苷分子的分离纯化
从绞股蓝皂苷中分离纯化得到18个达玛烷型三萜皂苷，这18个化合物的分子结构如图8.5，拟对这些皂苷类单体化合物对体内外抗高原缺氧导致的神经损伤的保护活性及其作用机制进行研究，以期从中发现具有神经保护作用苗头的皂苷分子。
图8.4 绞股蓝皂苷对小鼠海马组织内信号通路的影响
(https://www.daowen.com)
图8.5 化合物1#-18#的分子结构示意图
5.化合物1#～18#的抗缺氧活性及其作用机制研究
为了研究绞股蓝皂苷中哪些单体化合物对抗缺氧活性起到了至关重要的作用，我们对从绞股蓝皂苷中分离得到的达玛烷型三萜皂苷的抗缺氧活性进行体外评价。细胞增殖检测试剂盒CCK8检测结果（图8.6）显示，大部分化合物在缺氧环境下对PC12细胞具有保护作用，其中绞股蓝皂苷13#、14#、15#、16#、18#可显著提高缺氧条件下PC12细胞活力。这些结果表明，化合物13#～16#和18#可能参与了绞股蓝皂苷介导的体外缺氧损伤保护作用。
图8.6 化合物1#-18#对缺氧条件下PC12细胞活力的影响
对单体化合物的神经保护作用的机制进项探讨，Western blot结果（图8.7）显示，化合物13#～16#和18#显著提高PC12细胞中p-Akt和p-ERK的水平，激活CREB的表达，表明化合物13#～16#和18#和绞股蓝活性部位绞股蓝皂苷一样也是通过激活ERK、Akt和CREB信号通路来实现抗高原缺氧所致脑损伤的保护作用的。
图8.7 绞股蓝皂苷中单体化合物对PC12细胞内信号通路的影响
6.构效关系讨论
通过对构效关系（SARs）进行分析，有助于更有针对性地提供分子设计策略，从而有望设计和合成一种或多种活性、安全性优于苗头分子的先导化合物。根据化合物1#～18#在低氧环境下对PC12细胞的细胞活力的影响，我们对SARs进行了分析：①对比所有化合物（1#～18#）在低氧环境下对PC12细胞的保护作用，发现侧链具有20，23-dihydroxydammar-24-en-21-oic acid-21，23-lactone结构单元的化合物的活性显著优于侧链为其他类型的化合物，表明侧链的内酯环结构在对PC12细胞的保护活性起到了至关重要的作用。②化合物16#和17#，13#和14#具有相同的平面结构，不同之处在于C-23位的构型，对比缺氧环境下化合物对PC12细胞的保护作用，表明C-23为S构型时有助于提高化合物对PC12细胞的保护作用。③化合物16#、14#和7#，化合物13#、17#和4#，化合物18#和5#，分别具有相同的苷元结构、不同的糖基单元，对比缺氧环境下化合物对PC12细胞的保护作用，发现与C-3位连有一个糖单元和两个糖单元的化合物比较，C-3位连有三个糖单元时，显著降低了化合物对PC12细胞的保护作用。上述结论为下一步抗缺氧分子的靶向分离、设计和合成提供了理论参考依据。
7.总 结
体外内实验表明，绞股蓝的活性组分绞股蓝皂苷对缺氧损伤具有保护作用，其有效成分是绞股蓝皂苷中的达玛烷型三萜皂苷。绞股蓝皂苷和达玛烷型三萜皂苷活性化合物不仅可以激活PC12细胞中的Akt和ERK激酶，还可逆转低压缺氧环境下Akt和ERK激酶活性下降的趋势。基于小鼠低压缺氧暴露模型，发现通过绞股蓝皂苷预处理可有效保护海马组织DG区神经元的损伤，逆转ERK、Akt、CREB激酶活性下降的趋势。此外，绞股蓝皂苷预处理还可逆转BDNF mRNA水平降低趋势，表明CREB/BDNF信号通路被激活。这些结果表明绞股蓝皂苷及其活性化合物可作为有效的干预药物，预防低压缺氧诱导的神经损伤，为绞股蓝皂苷对中枢神经系统的保护作用的深入研究提供了有利的实验依据。但由于活性单体化合物的量无法支持体内实验，因此，我们将制备大量活性化合物，从而系统地研究苗头分子的体内抗缺氧活性及其作用机制。图8.8为绞股蓝皂苷改善缺氧性脑损伤的示意图。
图8.8 绞股蓝皂苷改善缺氧性脑损伤示意图