胚胎干细胞

一、概述

胚胎干细胞(ESCs)来源于早期胚胎囊胚阶段的内细胞团,具有自我更新及多向分化潜能,ESCs呈克隆性生长,可长期传代培养,表达多能性基因Nanog、OCT4等,可在体外定向诱导分化为三个胚层的各种类型成体细胞。

1998年,美国威斯康星大学的Thomson等首次成功建立了可以分化成几乎人体任何一种细胞(包括神经细胞、心肌细胞、造血细胞、肝脏细胞、胰腺细胞等)的人胚胎干细胞系,并应用于移植,为多种困扰人类的疾病提供了全新的干细胞来源。

随着对生殖细胞研究的不断深入,目前体外已能获得人ESCs源的原始生殖细胞以及减数分裂前期精子细胞。将ESCs在体外分化为上胚层样细胞,进而分化为原始生殖样细胞(primordial germ cell-like cells,PGCLCs),将它们迁移入胎儿生殖腺,具有减数分裂及产生精子能力,与卵子结合后移入缺生精管的生殖腺的新生鼠,可以产生健康后代。理想中诱导人ESCs体外分化为有功能的成熟精子,用于治疗临床上非遗传因素无精子症。

二、小鼠ESCs的研究进展

小鼠ESCs可在体外诱导分化为雄性生殖细胞,这已经获得多方研究证实。2003年,Toyooka等首先将小鼠ESCs标记GFP和LacZ后与可分泌骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)的滋养层细胞共培养,发现表达GFP或LacZ的细胞同时表达雄性生殖细胞特异基因Vasa的同源基因Mvh,且该类细胞植入睾丸小管后可产生有功能的生殖细胞。2004年,Geijsen等将小鼠ESCs通过拟胚体(embryoid bodys,EBs)诱导成胚胎生殖细胞,并进一步分化为单倍体雄性配子,注射入成熟卵母细胞后可形成二倍体细胞,继而受精卵可发育至囊胚期。2006年,Nayernia等将Stra8基因转入小鼠ESCs,再经过视黄酸诱导,成功获得了有功能的单倍体雄性配子。将该类配子经ICSI注射入小鼠卵细胞后,形成的二细胞胚胎移植回假孕母鼠体内可活产小鼠。(https://www.daowen.com)

2016年,我国周琪院士首次通过诱导胚胎干细胞获得了体外成熟的精子样细胞。将小鼠ESCs来源的原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)与新生小鼠睾丸细胞进行共培养,并在培养基中添加骨形成素和性激素后获得具有精子功能的细胞,这种细胞虽然不像正常成熟精子一样有尾且可以游动,但将其注射入卵母细胞后,形成受精卵,移植入母鼠子宫内可获得具生育力的后代。同年,Shikura等体外诱导获得小鼠SSCs并扩增成功。利用小鼠ESCs来源的原始生殖细胞样细胞与鼠胚睾丸组织细胞混合,离心后形成人工睾丸组织,这样的组织可分化形成SSCs,它可进行体外长期扩增,也可进一步分化为功能精子。

三、人ESCs的研究进展

目前,诱导人ESCs向雄性生殖细胞分化的研究也取得了一定进展。2004年,Pera等研究人ESCs来源的拟胚体可自发分化为雄性生殖细胞,表达Vasa、SCP3及TEKT1等多种生殖细胞特异的分子标志物。2009年,Kee等利用慢病毒载体转染系统,首次把携带有绿色荧光蛋白基因GFP和生殖细胞特异性基因Vasa的重组质粒(Vasa-GFP)导入人ESCs,建立转基因细胞系并诱导该细胞系向雄性生殖细胞分化,诱导2周后可观察到早期生殖细胞特异性表达基因DAZL,BLIMP1,STELLAR和Vasa表达量增加。其中,BLIMP1和STELLAR是PGCs的特异性表达基因,DAZL可促进PGCs的形成。

2013年,Gafni等在诱导人ESCs向生殖细胞方向分化过程中,首先将人ESCs诱导至原始状态,之后利用BMP4、LIF、SCF、EGF联合诱导,4～5 d后得到人原始生殖细胞样细胞。同年,Gkountela等应用新的分化体系,可使得人ESCs向PGCLCs分化的效率大于20%,同时发现SOX17/Blimp1可能是PGCLCs分化的关键因子。同年,Li等依次把人ESCs/iPSCs诱导为上胚层细胞,以及特异性表达整合蛋白β、SSEA1的PGCLCs,分选后的PGCLCs可被高效诱导分化为单倍体精子细胞。以上的体外研究都未能证实分化后的单倍体精子细胞是否具有成熟精子的功能,但为体外获得人类成熟精子奠定了坚实的研究基础。

四、ESCs向雄性生殖细胞分化存在的问题及展望

目前,体外诱导人ESCs分化为雄性生殖细胞的研究已取得一系列突破性成果,但真正得到功能成熟的人类精子,必须在研究精子发生机制的基础上进一步优化诱导方案。获得人ESCs必须破坏早期发育中的胚胎,胚胎来源有限,且受到社会伦理和法律的制约,这些严重阻碍了ESCs的临床研究和应用。ESCs虽然目前研究比较广泛,但诱导分化的条件及分化成熟的鉴定标准尚不成熟,如何避免分化不完全的ESCs在体内形成畸胎瘤仍然处于探索阶段。但ESCs可作为研究生殖细胞早期发育的可靠模型,其研究有利于探索人类生殖细胞的发育调控机制,从而给不孕不育研究带来曙光。