诱导性多能干细胞
一、概述
诱导性多能干细胞(iPSCs)是通过基因转导技术将某些与ESCs多能性密切相关的转录因子或小分子化合物导入人类或动物的体细胞中,使体细胞重编程而获得的多能干细胞。2006年,日本京都大学山中伸弥教授首次将四种转录因子Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc通过逆转录病毒系统导入小鼠皮肤成纤维细胞中,使之重编程后得到了具有ESCs特性的小鼠iPSCs。2007年,该研究小组又通过同样的方法成功获得了人iPSCs。同年,Yu等在美国实验室用另外一组转录因子,即Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28成功地将人的皮肤成纤维细胞重编程,得到人iPSCs。iPSCs具有自我更新能力,通过对称分裂方式增殖。该细胞还可以在特定的诱导条件下分化为不同表型的成体细胞,如神经上皮细胞、肝细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、生殖细胞等各胚层不同类型细胞。iPSCs功能几乎等同于ESCs,可以表达ESCs的各种表面标记物和分化为各种组织细胞。iPSCs的使用不受免疫排斥和破坏人类胚胎的伦理问题等限制,与其他干细胞相比,从患者的体细胞诱导而来的iPSCs有望成为细胞替代治疗的理想来源,在疾病发病机制模型研究及新药筛选等方面亦具有潜在价值,从而进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离。
研究表明,利用不同的转录因子组合或者不同的载体诱导系统,多种体细胞作为种子来源均可被重编程为iPSCs,如皮肤成纤维细胞、脂肪细胞、肝细胞及脐带血细胞等。iPSCs在增殖与分化能力、细胞表面标志物、基因表达模式以及拟胚体形成等方面与ESCs相似。在体外配子形成过程中,首先由多能干细胞分化形成原始生殖细胞样细胞,随后完成减数分裂的过程。人和小鼠的ESCs及其他成体干细胞体外诱导分化为生殖细胞的研究已取得极大进展,但因人ESCs来源于人类早期囊胚,其有限的来源和研究中涉及破坏胚胎的伦理道德及免疫排斥等问题,使其不适于大量重复性的实验研究。利用体细胞诱导得来的iPSCs,于体外诱导分化为生殖细胞,则巧妙地避开这些难题,使干细胞更合理地应用于临床治疗。
iPSCs来源的PGCs需要进行标志基因表达的鉴定,如c-kit、DDX4及SSEA1等。细胞能否进入减数分裂阶段可以通过检测减数分裂相关的标记基因进行判断,包括转化蛋白1、鱼精蛋白1和精子头粒蛋白等。小鼠iPSCs分化成生殖细胞可以通过四倍体互补作用实现,iPSCs已经成为一种体外研究生殖细胞分化机制的理想模型。
二、诱导分化的常用诱导剂
iPSCs可以向雄性生殖细胞诱导分化,诱导体系对iPSCs向生殖细胞诱导分化起到决定作用。在体外环境中模拟精子发生过程,可以在不同发育时期给予生殖细胞不同剂量、不同种类的诱导因子,诱导iPSCs向雄性生殖细胞方向分化。诱导因子的种类及添加时机的选择,应根据精子发生的发育阶段而定。常用的诱导因子包括:维A酸(retinoic acid,RA)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)等。
RA是维生素A的衍生物,在细胞分化、胚胎发育、器官形成和生殖等方面起到重要作用。RA通过激活精子形成相关基因Stra8促进生殖细胞进入减数分裂。有实验证明,小鼠睾丸支持细胞分泌的代谢酶Cyp26b1可降解RA,通过抑制RA信号,导致减数分裂延迟。当性成熟时,Cyp26b1的表达量下降,RA信号重新启动,减数分裂开始。因此,RA是生殖细胞是否进入减数分裂的关键因子。
iPSCs经拟胚体途径可分化为雄性生殖细胞。拟胚体是多种分化成熟度不一的细胞混合体,包含早期胚胎的全部组织细胞。2012年,Zhu等将iPSCs通过拟胚体途径在RA的诱导下进行分化,生殖细胞特异基因Vasa表达,表明RA诱导的iPSCs在体外分化为生殖细胞;精原干细胞标志基因CDH1和GFRα1的表达,说明体外RA诱导iPSCs分化为SSCs,但精母细胞的标志基因SCP3无表达,表明实验中的iPSCs没有分化为精母细胞。
BMP4属于转化生长因子-β家族的重要成员之一。在胚胎发育时期,BMP4作为分泌配体与丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合,激活Smad信号通路,从而调控ESCs/iPSCs向生殖细胞分化的启动。2011年,Panula等将成体细胞来源的iPSCs通过添加BMPs诱导分化得到PGCs,进而过表达DAZ、DAZL、BOULE等基因,可促进PGCs减数分裂得到单倍体精子细胞。LIF存在于PGCs细胞膜表面,与特异性受体LIF-R复合物结合,促进PGCs增殖。SCF是酪氨酸激酶受体c-kit的配体,SCF与c-kit相互作用有助于PGCs与体细胞的黏附及促进PGCs增殖。EGF通过与细胞表面的表皮生长因子受体结合发挥促进细胞增殖的作用。这三种生长因子在诱导前期主要用于维持PGCs存活以及促进PGCs增殖。(https://www.daowen.com)
三、动物及人类研究
在动物模型实验中,小鼠iPSCs更易于被诱导分化为雄性生殖细胞,并获得具有生育力的后代。2011年日本京都大学Saitou等成功地将小鼠皮肤成纤维细胞来源的iPSCs在体外诱导生成PGCs,将这些PGCs移植到小鼠生精小管内可发育为成熟精子,经ICSI注射入卵子后可繁育出子代小鼠。
2011年,Eguizabal等改进诱导方案,首次获得了来源于人iPSCs的单倍体精子细胞,依次加入RA的培养基分别培养3周,然后分选出CD9+/CD49f+/CD90-/SSEA4-细胞亚群,继续在含有Forskolin、LIF、b FGF及R115866的培养基中培养4周即可获得完成两次减数分裂的单倍体精子细胞。2012年,Easlay等研究发现人iPSCs可以直接分化为雄性生殖细胞,包括减数分裂后的精子细胞样细胞,产生的单倍体细胞可以表达aCROSIN、TRANSITION PROTEIN1、PROTAMINE1等精子细胞标志物。2015年,Sasaki等使用BMP4、LIF、SCF和EGF联合诱导人iPSCs向生精细胞分化,6 d后,有32%的细胞表达生殖细胞早期特异性基因Ep CAM和INTEGRINα6,同时得到了PGCLCs。2016年,Wang等用相同的方法诱导猪的iPSCs向生殖细胞分化,仅4 d便得到了PGCLCs。2017年,Dong等诱导小鼠ESCs向生殖细胞方向分化,单纯利用SSCs培养基诱导很难得到减数分裂后细胞,加入RA后诱导效率有所提高,但仍未得到更加成熟的精子细胞。
以上研究表明,BMPs、LIF、SCF、EGF四种因子联合作用,在诱导iPSCs向雄性生殖细胞分化的前期发挥重要作用。BMPs主要用于前期诱导iPSCs向PGCs方向分化;LIF、SCF和EGF主要发挥维持PGCs存活、促进PGCs增殖以及稳定BMPs诱导效果的作用。
四、存在的问题及展望
人iPSCs作为研究男性不育患者的体外模型具有良好的临床应用前景。对于生殖细胞缺乏的男性不育患者,可通过体细胞来源的iPSCs诱导分化为生殖细胞。患者自身来源的iPSCs不会发生免疫排斥,携带自身的遗传信息,同时避免了伦理争议。虽然iPSCs在诱导分化为生殖细胞方面取得了一定进展,但iPSCs的临床应用也存在一些挑战,如诱导效率及存活率低下、诱导过程复杂、诱导方法尚需改进等。在使用各种病毒载体系统进行诱导的过程中,介导了外源基因的插入,从而干扰内源基因的表达,重编程过程中导入的病毒载体系统可能引起基因组中某些原癌基因的表达激活;体细胞重编程为iPSCs过程中的转录因子c-Myc以及KLF4本身是致癌基因,在诱导过程中增加了iPSCs形成恶性肿瘤的风险。而通过小分子化合物诱导重编程获得的iPSCs,有可能改变染色体的表观遗传状态,最终导致不可预测的疾病风险。
iPSCs的诱导效率较低,初始细胞群产生患者的iPSCs会很困难,并非所有iPSCs在体外均可被诱导为雄性生殖细胞,在诱导iPSCs分化过程中,基因重组可影响分化结果。目前已从人iPSCs获得单倍体生殖细胞,但无论在体内还是体外,均未获得人类有功能的成熟精子。这些诱导后的细胞能否受精并产生正常后代,还需进一步的研究证明。人类精子发育成熟的周期比小鼠长、调控机制更复杂,因此实验动物模型并不能完全模拟人类精子发生过程。利用体外培养小鼠雄性生殖细胞的方法,也能培养出人PGCs,但由于物种差异,一些在人PGCs阶段表达的基因,如SOX17、TEAD4等在小鼠中并不表达。由于分化效率很低,诱导得到的多是早期的生殖细胞,很难分化为有功能的成熟生殖细胞。
临床上需要验证体外培养获得的“人造精子”是否具备真正精子的功能,必须进行人体胚胎移植,其间存在的伦理以及法律问题目前也阻碍了相关研究进展。理论上来说,设想未来对于有遗传缺陷的男性不育患者,可通过基因编辑技术,在iPSCs阶段处理变异基因,以此减少致病因子,后再诱导获得遗传正常的成熟精子,从而将基因治疗提前到精子发生阶段。若体外能成功诱导人iPSCs分化为单倍体精子细胞甚至功能精子,再结合辅助生殖技术,则无精子症患者可有望生育具有自身遗传物质的后代。