间充质干细胞
一、概述
间充质干细胞(MSCs)是具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞,是一类具有特异形态、表型及功能性质的细胞群体。主要来源于胚胎发育早期的中胚层,具有向中胚层各种细胞分化的能力,广泛存在于人体多种组织中,如脂肪、骨髓、软骨、滑膜、羊水、脐带、羊膜、胎盘、脐带血等。大量的研究报道MSCs具有向内胚层、中胚层以及外胚层分化的潜能。MSCs在形态上呈纺锤形、成纤维细胞样,具有黏附性,同时具有高度自我更新能力和较弱的免疫源性,易于体外分离培养、扩增,易于导入外源基因。由于组织来源和培养方法的差异,MSCs会呈现出不同的形态。虽然没有特异性的表面标志物,但是各种MSCs具有相似的细胞表面标记表达,如高表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD11a、CD11b、CD14、CD19、CD31、CD34、CD45及HLAⅡ抗原。而不同组织来源的细胞标记会略有不同,这种差异可能会影响到生物活性,如迁移能力、归巢性、分化潜力及可塑性等生物特性。
目前,国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy,ISCT)对MSCs定义了如下标准:①在体外培养体系中贴壁生长;②表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达造血干细胞的表面标志如CD14、CD19、CD34、CD45、CD79a或HLADR等;③在体外可以诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。在机体内MSCs的免疫表型鉴定仍不清楚。另外,不同年龄段的MSCs,增殖能力也存在明显差异。
MSCs是否具有转分化作用潜能,目前学术界仍存在争论。有报道称MSCs可转分化为内胚层的肝细胞和胰岛样细胞,以及外胚层的皮肤细胞、神经元和神经胶质细胞等。理论上,不同组织来源、不同年龄供体的MSCs本身分化潜能大有不同。即便MSCs具备某些干细胞本身维持未分化状态的基因,但无论在体外培养环境或移植入受体的微环境,MSCs难以接受某些特殊的信号转导,很难具备促进MSCs向靶细胞分化的适宜条件。
目前研究认为,MSCs通过分泌各种细胞因子、重建细胞外基质、促进新生血管生成、抑制局部免疫反应、抑制细胞凋亡、刺激内源性干细胞的增殖等效应从而实现受损组织的修复。MSCs的旁分泌作用可能是MSCs促进组织修复与再生的重要机制之一。蛋白质组学证实MSCs能广泛产生促血管形成和促进组织修复的可溶性细胞因子,例如巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、干细胞因子、血管内皮生长因子等。近期研究发现MSCs还可以分泌细胞微囊泡(microvesicle,MV)。MV是细胞在生理状态或应激情况下由细胞脱落的膜性小囊泡,囊泡内可携带蛋白质、信使RNA、小RNA等作为细胞间信号转导分子,同时具备免疫抑制、抗原提呈以及生物信息传递等功能。MV的发现可能是MSCs用于临床治疗的新的探索领域。
MSCs是继造血干细胞之后进入临床应用的又一成体干细胞。目前为止,美国FDA已经批准了100多项关于MSCs的临床应用研究,其治疗效果令人期待,主要用于神经系统退化性疾病及自身免疫性疾病的治疗,如脊髓损伤修复、移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮、肌萎缩型脊髓侧索硬化症、多发性硬化症等,MSCs还可以作为基因治疗的载体应用于临床治疗。
二、MSCs在男性生殖领域的研究
2006年,Nayernia等在体外用RA诱导Stra8-EGFP转基因小鼠的BMMSCs,发现3%的BMMSCs表达Oct4、Dazl、Piwil2、Stra8等干细胞和生殖细胞标志,提示BMMSCs在体外能诱导分化为早期雄性生殖细胞。他们进一步将诱导的细胞移植到白消安消除内源性精子的小鼠睾丸内,8周、12周后分别观察到移植的细胞在睾丸内增殖,并迁移到生精小管基底膜,但并不表达减数分裂后生殖细胞标志如过渡蛋白2和外层顶体精子膜蛋白,提示BMMSCs在体内不能进一步分化为精母细胞和精子细胞。(https://www.daowen.com)
2007年,Lue等学者的研究也支持这一观点,他们在白消安预处理的野生型小鼠和c-kit基因缺失小鼠的生精小管中,注入了标记有GFP的小鼠骨髓干细胞,移植后发现部分GFP(+)的供体细胞能够呈现出精原细胞或精母细胞的特征,同时表达Vasa基因,结论是骨髓干细胞可在体内外条件下分化为早期的生殖干细胞。但这些衍生细胞停留在减数分裂前期阶段,不能进行有效的减数分裂。另外,骨髓干细胞在诱导培养过程中不能形成拟胚体,这与胚胎干细胞的分化特征也完全不同。
2008年,Lassalle等报道如果小鼠体内存在RA的刺激,成熟BMMSCs能够表达生殖细胞标志,但将其移植到睾丸内却没有精子产生。提示骨髓来源的MSCs并不能转分化产生生殖细胞。
Huang等在体外培养的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UCMSCs)加入睾酮、RA以及睾丸提取液,最后诱导得到类生殖细胞,并能检测到生殖细胞相关的表面标志物,不过这种细胞却未能有效进入减数分裂阶段,提示h UCMSCs在RA诱导的培养条件下不适合向生殖细胞的晚期分化。Tamadon等发现,睾丸和脐带条件培养基、BMP4、RA可促进人脐带间充质干细胞向男性生殖细胞发育。支持细胞做饲养层细胞提供的微环境也能促进h UCMSCs向男性生殖细胞分化。TGFb1处理BMMSCs 21 d可有效促进其向精细胞分化,并促进其在睾丸内生存、归巢和形成集落。其可靠性有待进一步验证。
在生殖男科领域,基于干细胞的男性生育力维持、修复与重建成为研究热点后,通过发挥MSCs强大的旁分泌功能,改善体内精原干细胞增殖分化的微环境,这将是未来MSCs治疗男性不育的重点研究方向。2014年,熊承良课题组通过移植h UCMSCs至白消安诱导的无精子症小鼠睾丸内,提高了生精细胞特异性基因的表达。Kadam等通过移植SSCS和经TGF-β1处理的MSCS,利用旁分泌b-FGF、SDF-1等明显改善SSCs的局部微环境,促进SSCs的归巢效率,从而起到改善生育力的作用。
三、MSCs应用于生殖男科领域存在的问题和前景
目前MSCs在生殖男科领域的研究尚存较大争议。首先,将MSCs移植到受体睾丸内,是否能够存活与增殖、移植成功后MSCs的具体定位,以及MSCs向雄性生殖细胞的分化与否尚都不能明确;其次,MSCs移植后对受损睾丸组织的生精功能是否具有修复作用不甚明确;再次,目前没有证据表明MSCs能够克服减数分裂障碍,分化为有功能的成熟精子并能产生后代;最后,虽然目前尚无MSCs发生免疫排斥或形成畸胎瘤的报道,但是MSCs体内移植后长期安全性尚不能明确。
MSCs在生殖男科领域中的研究依然停留在动物实验阶段,很多研究集中在MSCs分化为早期生殖细胞和促进生精修复的可能性,研究如何促进移植的MSCs体内存活、分化和功能发挥,进一步提示干细胞微环境以及旁分泌作用的重要性。随着研究的逐渐深入,人们将会对MSCs的分化潜能和旁分泌功能、MSCs诱导的生殖细胞如何有效地启动减数分裂以及远期致瘤性和致畸性有更广泛而深入的认识。基于MSCs的治疗在生殖男科领域特别是男性不育症的治疗方面将会有更广阔的应用前景。