miR-7调控胃癌恶性生物学行为的功能与机制
mieroRNA-7（miR-7）于2001年首次在果蝇中被发现。2008年以来，miR-7在肿瘤中的作用被陆续报道，称其在肝癌、肺癌和乳腺癌中表达降低，发挥抑癌基因的作用；近年来，亦有报道指出血iR-7可促进肾癌的发生。可见，miR-7在肿瘤中的功能与机制仍不明确。本实验室前期通过比对高、低转移胃癌细胞系的miRNA表达谱，发现miR-7在高转移细胞系中表达量显著降低，提示其可能在胃癌发生和发展过程中发挥抑癌基因的作用。基于文献报道和前期研究结果，本研究将进一步聚焦miR-7，为阐明其在胃癌恶性生物学行为中发挥的关键功能和调控机制提供理论和实验依据。
实时定量PCR结果表明，与正常胃上皮细胞相比，miR-7在胃癌细胞中表达降低，且在高转移胃癌细胞中表达进一步降低，与癌旁正常组织相比，miR-7在胃癌组织中的表达降低，且在胃癌转移灶中的表达较原发灶进一步降低；组织芯片ISH结果表明，miR-7在大多数胃癌临床标本中呈低表达，其表达水平与胃癌分级和分期呈负相关，与胃癌患者生存期呈正相关，并可作为判断胃癌预后的独立危险因素。通过转染和感染miR-7的模拟物和抑制物，以及miR-7的过表达载体和shRNA干扰载体，能够有效上、下调miR-7在胃癌细胞中的表达水平；细胞生长曲线、平板集落形成实验和软琼脂集落形成实验表明，miR-7能够抑制胃癌细胞的体外生长过程；通过流式细胞术检测细胞周期结果表明，miR-7能够抑制胃癌细胞周期进展；通过流式细胞技术检测细胞凋亡结果表明，miR-7能够促进胃癌细胞早期凋亡；Transwell迁移与侵袭实验结果表明，miR-7能够抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力；裸鼠移植瘤实验结果表明，miR-7能够抑制胃癌细胞的体内生长过程；裸鼠转移瘤实验结果表明，miR-7能够抑制胃癌细胞形成转移灶的能力。
在胃癌细胞中瞬时转染miR-7后，联合运用cDNA基因芯片、iTRAQ技术和生物信息学方法，在全基因组的mRNA和蛋白水平高通量筛选出下调的差异表达基因分别为180个和75个，其中重点关注miR-7对RELA、FOS和IGF1R等与肿瘤增生和转移表型密切相关基因的调控。双荧光素酶报告基因实验结果表明，miR-7能够直接结合RELA、FOS和IGF1R的3'-UTR上的结合位点；实时定量PCR和Western blot结果表明，miR-7与RELA和FOS的mRNA和蛋白表达均呈负相关，但其与IGFIR的负相关关系仅存在于蛋白水平；通过上调或下调RELA和FOS的功能实验结果表明，RELA和FOS能够促进胃癌细胞增生，抑制胃癌细胞凋亡，功能挽救实验结果表明，miR-7能够通过调控RELA和FOS抑制胃癌增生，进一步的机制研究表明，miR-7可通过负向调控IKKε 抑制RELA的激活；通过上调或下调IGF1R的功能实验结果表明，IGF1R能够促进胃癌细胞侵袭和转移，功能挽救实验结果表明，miR-7能够通过调控IGF1R抑制胃癌侵袭和转移，进一步的机制研究表明，miR-7可通过抑制IGF1R，降低Snail的表达，间接促进E-cadherin的表达，抑制胃癌细胞的上皮-间质转化（EMT）过程。(https://www.daowen.com)
实时定量PCR结果表明，在胃上皮细胞中过表达IKKε 和RELA 可抑制pri-miR-7的表达，在胃癌细胞系中干扰IKKε 和RELA可促进pri-miR-7的表达；通过生物信息学方法，预测人类基因组中miR-7的3个编码基因的启动子区域共存在7簇NF-κB的结合位点；ChIP实验结果表明，RELA能够与miR-7-1和-2基因的启动子区域相结合；免疫荧光结果表明，过表达miR-7可抑制IKKε 和RELA的表达，并能够抑制RELA的核转位；实时定量PCR结果表明，过表达miR-7可抑制NF-κB信号通路下游多个效应分子的表达；启动子报告基因和实时定量PCR结果表明，幽门螺杆菌感染能够上调NF-κB转录活性，并抑制pri-miR-7的表达。
本研究明确了miR-7在胃癌细胞和组织中的表达模式，揭示了miR-7表达降低与胃癌发生、发展的相关性；明确了miR-7在调控胃癌恶性生物学行为中所发挥的功能，表明其在胃癌中起到抑制细胞增生、促进凋亡和抑制转移的作用；揭示了miR-7/IKKε/RELA和miR-7/IGF1R/Snail两条分子通路分别影响胃癌增生和转移表型的分子机制；揭示幽门螺杆菌感染导致NF-κB分子通路过度激活对miR-7在胃癌中表达降低的重要影响。本研究为认识miR-7在胃癌恶性生物学表型中发挥的关键功能与调控机制提供了理论基础，并使得miR-7有望成为胃癌临床治疗行之有效且机制确凿的新靶点。
（李 峰）