细胞内的氧感知
分子氧对细胞的生物能量和代谢至关重要，因此维持足够的氧气供应需要感知氧水平和调控基因表达机制，这在低氧分压（缺氧）条件下尤为重要。缺氧会引发不同的生理反应，如新陈代谢、血管生长、红细胞产生或细胞凋亡，缺氧反应是多系统反应，包括呼吸、心血管、代谢和脑血管的协调反应［45］，这些系统及其生理功能需要数千个基因在数百个转录因子控制下的协调表达来维持。现在已认识到，氧是可以参与大量分子过程的信号分子，从而影响基因表达控制，了解控制细胞氧传感和响应的分子机制有助于发现氧参与的新通路［46］。
吸氧和能量转换是每个脊椎动物体赖以生存的生物学过程。众所周知，线粒体细胞呼吸过程中的氧气结合是将食物转化为生化能量（例如ATP）的关键代谢环节。在以前，特别是在哺乳动物中，一些基本问题尚不清楚，例如，关于如何在细胞中感知氧气，并利用不同细胞过程产生的生理效应进行适应。直到科学家在哺乳动物细胞中发现了一个特定的氧气感知系统，这是一项突破性的发现，开辟了一个全新的科学领域。致力于这一基本领域的主要科学家是格雷格·塞门扎（Gregg L. Semenza）、威廉·凯林（William G.Kaelin）和彼得·拉特克利夫（Peter J. Ratcliffe）。由于在发现氧传感系统方面的贡献，他们在2016年共同获得拉斯克基础医学研究奖，随后又获得2019年诺贝尔生理学或医学奖［47］。了解氧气感应系统，尤其是人体中的氧气感应系统，不仅对了解我们自身的秘密，而且对了解正常或异常氧气状态下氧气感应途径的生理相关性都具有重要意义。氧感应通路的失调可能导致许多疾病，如慢性高原病、中风、肾脏或心血管疾病、炎症性疾病和癌症等。
氧传感发现的探索始于EPO的发现，虽然人们很早就知道EPO能刺激骨髓产生红细胞，从而提高血液携氧能力，细胞缺氧时在特定的生理条件下EPO水平会升高，但机体如何感知缺氧以控制EPO表达的分子机制尚不清楚。自从1992年格雷格·塞门扎等人发现缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）以来［48-49］，人们逐渐认识到，由HIF调控的EPO产生和红细胞生成过程是细胞适应缺氧变化的主要机制。
（一）缺氧诱导因子的结构及功能
维持氧稳态是细胞适应氧变化的最基本过程，其异常通常会导致人体各种疾病，细胞水平氧检测和适应的中心调节因子是HIF［50］。HIF蛋白是一个进化上保守的转录因子家族，目前所知亚型有HIF-1、HIF-2和HIF-3，在N端具有基本的螺旋-环-螺旋（HLH）结构域，以及参与二聚体形成并与DNA结合的PAS（period-ARNT-single minded）结构域。家族中的每一个亚型都呈异二聚体形式，由氧敏感的α亚基和组成型β亚基通过HLH-PAS结构域构成。在C端存在一个氧依赖降解（oxygendependent degradation domain，ODD）结构域，以及两个转录活化所需的反式激活（transactivation domains，N-TAD，C-TAD）结构域（见图2-3）。α单元有3个同系物（HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α）。尽管HIF-1α普遍表达，但其他两种表达限于特定的细胞系或组织。HIF-1α和HIF-2α（又称EPAS1，由EPAS1基因编码表达）的功能比HIF-3α研究得相对深入。在HIF-1的两个亚基中，HIF-1α亚基介导了HIF转录复合体的氧感受性，HIF-1β亚基呈组成性表达，对氧无反应，又称芳香烃受体核转位蛋白（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT），HIF-2α、HIF-3α也与HIF-1β形成二聚体［51-53］，HIF-1β与其他HLH-PAS蛋白异二聚化并过量存在，因此，α亚基蛋白水平决定了HIF转录活性［54］。HIF蛋白系统的复杂性反映了其在缺氧期间对不同细胞过程的精确适应性［47，55］。
图2-3 HIF的基本结构
HIF发挥了对氧稳态的主要调节作用。在所有有核细胞中，HIF-1的活性都是由缺氧诱导的，对于心脏、血液、血管和呼吸控制中心的正常发育，HIF-1是必需的。HIF-1还控制人体对缺氧和缺血的生理反应，通过红细胞生成和血管生成刺激增加氧气输送，以及通过增加葡萄糖转运和糖酵解实现对缺氧的代谢适应。目前已知的HIF-1靶基因超过50个，可能有15%的人类基因受到HIF-1调控。HIF-1α必须与HIF-1β亚基聚合形成异源二聚体才能发挥转录因子的作用［55］。该二聚体可介导EPO、血管内皮生长因子、糖酵解过程中的关键酶——磷酸甘油酸激酶1（phosphoglycerate kinase 1，PGK1）表达水平的变化，以及能量代谢、炎症、血管修复、氧化应激等缺氧反应的产生［52］。
（二）HIF氧信号通路
1.氧气如何调节HIF
在常氧状态下，HIF-1α蛋白迅速降解，很难检测；缺氧期间，HIF-1α变得稳定，并从细胞质转位到细胞核，在那里与HIF-1β二聚化，形成具有转录活性的HIF复合物。激活的HIF复合物随后与靶基因调控区域的缺氧反应元件（hypoxia response element，HRE）结合，并结合转录辅助因子（CBP/P300）来诱导基因表达。HIF-1α仅在缺氧条件下被诱导，而其mRNA水平保持组成性表达，表明HIF-1α蛋白稳定性存在翻译后调节机制［47］。
威廉·凯林在研究希佩尔-林道综合征（von Hippel-Lindau syndrome，VHL）时发现，缺乏功能性VHL基因的细胞组成性地表达高水平的缺氧调节基因，将野生型VHL引入细胞可以恢复正常的生理调节［56］。VHL蛋白在细胞质内与延伸蛋白B（elongin B）、延伸蛋白C（elongin C）、cullin-2（CUL2）和ring-box 1（Rbx1）形成的复合物具有泛素连接酶作用［57-58］，VHL是E3-泛素连接酶复合物中的关键底物识别衔接蛋白。在常氧条件下，缺氧诱导因子ODD结构域中2个脯氨酸残基的羟基化和1个赖氨酸残基的乙酰化促进了HIF-1α与VHL磷酸化蛋白（pVHL）的结合，并与募集的多种泛素蛋白结合，共同组成泛素连接蛋白酶复合体，该复合体作用于HIF-1α从而被26S蛋白酶体降解［56，58-59］。常氧时，在细胞内还存在另外一种阻碍HIF-1α作用的因子，即HIF-1抑制因子（FIH-1），FIH-1使HIF-1α C端反式激活结构域第803位天冬氨酸残基羟基化，从而阻止了HIF-1α与转录激活辅助因子（CBP/P300）的结合，使下游靶基因不能表达［59］。(https://www.daowen.com)
2.氧浓度如何调节VHL和HIF-1之间的相互作用
彼得·拉特克利夫和威廉·凯林认为HIF-1α在正常氧气水平下进行脯氨酸羟基化，而VHL可以特异性识别HIF-1α的这种羟基化形式。拉特克利夫的研究表明，脯氨酸-4-羟化酶结构域蛋白（prolyl-4-hydroxylase domain proteins，PHD）可催化HIF-1中脯氨酸残基的羟化。PHD对氧气的亲和力低，氧气浓度即使是很轻微地降低也能抑制PHD，导致脯氨酸羟基化减少，与VHL的结合减少，从而导致HIF-1蛋白的积累［56］。PHD属于2-氧戊二酸（2-oxyglutaric acid）依赖性双加氧酶超家族［52］，在哺乳动物中发现了4种PHD家族蛋白，即PHD1（也称为egg-laying-defective nine proteins 2，EGLN2）、PHD2（EGLN1）、PHD3（EGLN3）、PHD4，但关注热点主要是前3种［47，58，60］。HIF-1α脯氨酸残基羟基化是HIF降解的关键，而催化此过程的PHD便是全程限速酶，需要氧作为共底物，表明PHD可以作为细胞中的氧传感器。调节PHD活性的因素包括氧分压、作为共同亚基的α-酮戊二酸、铁离子、抗坏血酸等［60］（见图2-4）。
图2-4 HIF氧信号通路
（三）EPO在红细胞生成中的表达调控
对慢性缺氧的适应依赖于氧气敏感的脯氨酸羟化酶（PHD）诱导HIF信号通路，该通路调节一系列编码转运蛋白、酶、细胞因子和生长因子的基因表达。这些效应驱动分子和组织修饰，减少细胞对氧气的需求，并增加血液中氧气运输量和使氧气供应到组织。红细胞生成受多种因素调控，其中氧感应通路是肾脏EPO合成的主要调节器。EPO从肾脏释放并与骨髓中红系祖细胞上的EPOR结合，导致红细胞生成增加。这些体内平衡机制的任何失衡都会导致红细胞生成失调和血液系统疾病。例如，编码氧感应途径和EPO产生调节（HIFEPO途径）关键参与者，即VHL、EGLN、EPAS1和EPO等的基因突变（见表2-1）。
表2-1 氧传感途径和EPO表达的主要基因
EPO是红细胞生成的关键调节剂，其不断的产生是维持RBC更新所必需的。EPO表达受HIF的调节，在应激性红细胞生成过程中，EPO表达也可被骨髓成骨细胞诱导。组织缺氧状态下，HIF通过氧感应通路诱导肾脏中EPO表达，此后EPO被释放入血，并与骨髓中红系祖细胞上的EPOR结合，从而促进红细胞生成，增加组织供氧，因此，该通路也被命名为HIFEPO通路。
在正常氧气条件下，HIF-1α亚基被泛素-蛋白酶体系统持续转录、翻译和降解，在HIF-1α被PHD羟化以及VHL-E3泛素连接酶复合物泛素化后降解［61］，血液中氧含量降低导致组织缺氧，这是EPO表达增加的主要刺激因素［62］。在缺氧条件下，PHD使HIF-1α脯氨酸羟基化减少，HIF-1α蛋白能稳定转移到细胞核，在那里与ARNT（HIF-β）形成异二聚体。HIF-1α-ARNT复合物与EPO基因启动子/增强子区域的缺氧反应元件（HRE）结合，并通过HIF-1α反式激活域（TAD）招募中心转录共激活因子，组蛋白乙酰转移酶p300和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的结合蛋白（CREBbinding protein，CBP）结合［63］。在与肾脏EPO产生相关的PHD和HIF-1α亚型中，PHD2和HIF-2α发挥主要作用［64］。慢性高原病患者骨髓细胞中HIF-2α和EPO-mRNA蛋白表达较高原健康居民明显升高。此外，HIF-2α在慢性高原病患者中的表达与EPO、HGB水平显著相关。相比之下，HIF-1α和EPOR-mRNA蛋白表达在慢性高原病患者与高原健康居民中没有显著差异［65］。
除了调控EPO外，HIF还通过其他途径调节红细胞生成，例如HIF-1α能上调转铁蛋白和转铁蛋白受体表达，促进铁转运，通过抑制铁调节素（hepcidin）增加铁的利用。在敲除HIF-2α基因的小鼠中发现，HIF-2α在不影响EPO的情况下，通过调节血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1），在内皮细胞对红细胞生成的支持作用方面发挥重要作用［66］。