4.3.1　美国白蜡分子生物学特征

4.3.1.1　抗寒基因的分离

根据已有抗寒相关基因及其转录因子的相关信息，利用Genbank和EST库查询的序列设计抗SAD基因和CBF基因简并性引物，分离鉴定SAD基因和CBF基因部分片段，根据已获得序列设计特异性引物，然后利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）方法获得基因的全长序列，比较基因结构并进行系统进化分析。利用Primer Premier 5软件进行引物设计，DNAman5.2.2和CLUSTAL W 1.81软件进行序列分析，PredictProtein和SWISS-MODEL进行蛋白质二、三级结构预测，MEGA 3.1生成进化树。

4.3.1.2　基因表达水平检测

根据已知的SAD基因和CBF基因及本研究所获得的SAD基因和CBF基因序列设计引物，利用半定量PCR或实时荧光定量PCR技术对不同温度梯度下或不同部位的SAD基因和CBF基因的表达规律进行分析。

4.3.1.3　基因及氨基酸序列获取

利用RT-PCR技术和cDNA末端快速扩增技术获得了SAD基因及CBF基因的全长序列，并推断出其氨基酸序列。分别见图4-13、图4-14。

4.3.1.4　FaSAD基因及FaCBF基因Blastn结果

对克隆出的SAD基因全序列进行分析，通过在Genbank和EST库中进行Blast比对发现（图4-15），所有序列均与来源于麻疯树、毛果杨、油樟、橄榄等林木的相应SAD基因具有一定相似性，同时存在一定的差异。通过进一步的比对，发现克隆出的SAD基因与已知其他物种的SAD基因氨基酸序列相比，具有典型的结构特征，所有的SAD基因氨基酸都含有2个独立的SAD基因结构域和类铁蛋白结构域的保守区。故初步确定为新型SAD基因，将其命名为FaSAD。

图4-13　FaSAD基因全长序列1643bp

图4-14　FaCBF基因全长序列917bp

对所克隆出的CBF基因进行全序列分析，通过在GenBank和EST库中进行Blast发现（图4-16），与来源于毛果杨、桉树等林木的相应基因具有一定相似性，同时也存在一定的结构差异。进一步的分析发现具有典型的ACT-UUR-ACR-like功能域。故初步确定为新型CBF基因，将其命名为FaCBF。

图4-15　SAD基因全序列Blast比对

图4-16　CBF基因全序列Blast比对

4.3.1.5　FaSAD基因和FaCBF基因半定量PCR及实时荧光定量PCR表达分析

不同白蜡苗木部位FaSAD基因半定量表达结果如图4-17所示，从图4-17中可以看出FaSAD基因在茎中的表达量最高，其次是根和种子，在叶片中表达量最低。美国白蜡苗木不同冷诱导时间FaCBF基因实时荧光定量表达分析如图4-18所示，从图4-18中可以看出，随着冷处理时间的增加，FaCBF基因表达量逐渐增加，在12 h时FaCBF的表达量最高，之后随着冷处理时间的增加呈递减趋势。

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