4.3.2 美国白蜡种源遗传多样性
美国白蜡抗逆性强，耐寒、耐旱、耐盐碱，适生范围广，是良好的防风固沙、沿海湿地造林的经济树种。另外，其外形亮丽，树势雄伟，树冠茂密，绿叶期较长，也是城镇绿化的优良树种。目前应用分子标记技术在白蜡树种上的研究尚未见报道，因此开展新型分子标记技术研究对促进白蜡育种进程具有重要意义。相关序列多态性分析（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是一种基于PCR的分子标记技术，因其技术简便、快速，不需要预知物种的序列信息，多态性和信息量丰富等特点，故而成为目前一种比较理想的分子标记技术。近年来在植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图谱构建、重要性状的基因定位等方面得到了广泛的应用，在国内利用该标记进行林木分子遗传育种研究也已陆续开展。本研究利用SRAP分子标记技术对从美国引进的4个不同种源的美国白蜡材料进行了遗传多样性分析，对4个不同地域的美国白蜡间的遗传分化程度，探讨用SRAP标记研究白蜡属植物遗传多样性中的可行性，并为该引进树种在辽宁地区改良育种工作中亲本筛选及利用提供理论基础。
4.3.2.1 白蜡基因组DNA的提取
图4-24 1%琼脂糖检测基因组DNA
上图M：λDNA/HindⅢmarker，1～8为美国白蜡基因组DNA，图中1～5为λDNA，从左到右分别为15 ng、30 ng、60 ng、90 ng、150 ng，6～15为稀释后的DNA。
4.3.2.2 SRAP引物选择
图4-25 不同引物组合对扩增结果的影响
M：DL2000 marker；1～16为16个SRAP引物组合
4.3.2.3 SRAP-PCR反应条件的确定
利用正交试验设计L16（45）对美国白蜡SRAP-PCR反应体系的5个因素（Mg2＋、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA）在4个水平上进行优化试验，结果表明，Mg2＋浓度对反应体系的影响最大；建立的美国白蜡SRAP-PCR最佳体系（25 μL）为：Mg2＋2.5 mmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.5 U、dNTPs 0.25 mmol·L-1、引物0.4 μmol·L-1、模板DNA 40 ng·μL-1。利用优化后的反应体系对4个美国白蜡材料进行了种间多态性检测，结果表明，该体系能够很好地满足美国白蜡基因组SRAP扩增的要求。这一优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术对美国白蜡进行分子遗传研究提供基础（图4-26）。
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图4-26 SRAP-PCR正交试验设计PCR电泳
M：DL2000 marker；1～16为16个SRAP引物组合
4.3.2.4 SRAP的多态性谱带分析
随机选取了8对SRAP引物对4个不同种源的美国白蜡进行了PCR扩增，8对引物在所有的供试材料中均有多态性，在4个美国个体间共扩增出87个清晰的可辨认条带，片段长度集中在100～1 000 bp，其中多态性条带有43个，多态性比率为49.4%，平均每个引物扩增出10.8条带，多态性条带5.4条（图4-27）。
图4-27 不同引物组合在4个不同种源美国白蜡材料中扩增出的SRAP条带
4.3.2.5 不同种源遗传多样性分析
将31对引物组合扩增出的87条电泳谱带建立0，1数据库，计算出的各材料间的遗传相似系数，4个不同种源美国白蜡品种的遗传相似系数在0.348 8～0.651 2，其中宾夕法尼亚种源和密西西比种源的遗传相似系数最大，表明它们之间的遗传变异较小；亚拉巴马种源和田纳西种源遗传相似系数最小，显示它们之间存在较大的遗传差异（图4-28）。从本研究绘制的聚类分析图4-29中可以看出，4个种源的美国白蜡遗传差异都相对较大，这可能由于生长地不同引起的。不同地域气候环境使得美国白蜡不同种源间的遗传差异较大，也说明其种内遗传多样性比较丰富，基因变异程度较广泛。亚拉巴马种源和田纳西种源之间差异很大的另一个原因也可能原本是两个不同白蜡品种在后来命名使用时发生混乱，导致成为同一品种，这需要进一步确认。
图4-28 4个美国白蜡种源的相似性系数
图4-29 4个美国白蜡种源的聚类分析树状图
