3.4.2 单细胞培养方法和影响因素
1）培养方法
植物细胞培养根据培养方式不同可分为悬浮培养、看护培养、平板培养、微室培养等，如图3.5所示。
图3.5 单细胞培养的各种方式
（1）悬浮培养
细胞悬浮培养是将植物游离细胞或细小的细胞团，在液体培养基中进行培养的方法。它是从愈伤组织液体培养技术的基础上发展起来的一种最常用的细胞培养方法。1953年，Muir成功地对烟草和万寿菊愈伤组织进行了悬浮培养。悬浮培养的特点：培养细胞可不断增殖，且生长速度快，适于大规模培养及工业化生产有用的细胞次生代谢物；能大量提供分散性好且较为均匀的细胞，用于细胞基础研究、突变体筛选或作为遗传转化受体等；大规模悬浮培养成本较高，因为它需要配置大型摇床、转床、连续培养装置、生物反应器、倒置显微镜等特殊设备。
（2）看护培养
看护培养是用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。Muir首创此法并获得了烟草单细胞体系。具体做法是将一张8 mm见方的无菌滤纸放到一块几毫米大的愈伤组织上，l天后，将细胞培养在已充分吸收愈伤组织渗透液的湿滤纸上。单细胞分裂形成肉眼可见的小细胞团后，转移至琼脂培养基上培养。看护培养方法的优点是简便易行，效果好。但不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。
（3）平板培养
平板培养方法，即按一定细胞密度通常为103～105个细胞／mL，制备好单细胞悬浮液，再将含琼脂的培养基加热熔化后冷却至35℃左右，尚未凝固时与细胞悬液混合，迅速倒入培养皿形成的约1 mm厚的平板进行培养。此法是1960年由Bergman首创的。平板培养的优点是单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株选和突变体筛选的常用方法。该方法筛选效率高、筛选量大、操作简便，广泛用于研究细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢物合成等领域。但该方法缺点是通气状况不佳，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。
（4）微室培养(https://www.daowen.com)
微室培养是在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。具体做法：将两滴单细胞悬浮培养液滴于载玻片中央，在其四周放一圈液状石蜡，左右两侧各加一滴液状石蜡并分别置一张盖玻片，第三张盖玻片架在两个盖玻片之间，中间形成一个微室。微室培养的优点是可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化、胞质环流规律等过程。但由于培养基太少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。
2）影响因素
单细胞培养比愈伤组织培养更困难，因为它对营养条件和环境条件要求更高。培养基成分和初始细胞密度是影响单细胞培养的关键因素。
（1）条件培养基
条件培养基指生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基。由于愈伤组织或细胞在生长过程中向培养液（基）释放了一些特殊代谢物，更有利于单细胞生长和分裂，所以在选用的培养基中可加入一定量的条件培养基。但有些适宜愈伤组织形成的培养基，也不一定适合作为悬浮培养基，而要在此培养基配方的基础上进行调整。常用的培养基有N6、MS、B5、LS等培养基，附加CH、CM等营养物。
（2）细胞起始密度
开始培养时，最低的、有效的单位体积内的细胞数目为细胞起始密度。一般为104～105个细胞／mL。
（3）生长调节剂
在单细胞培养中，补充生长调节剂有利于细胞分裂。特别是对低密度细胞的培养，必须加入生长调节剂，细胞才能分裂。如培养低密度旋花属细胞时，要求有细胞分裂素和几种氨基酸，而同材料的愈伤组织培养则无需添加上述物质。
（4）pH值
培养基适当的pH可促进细胞分裂。悬浮培养时，pH变动较大，易迅速升值变为近中性，而pH的变化直接影响铁盐的稳定性，故悬浮培养时，还需加入磷酸钙、碳酸钙等pH缓冲剂。
