4.3.2 影响原生质体培养的因素
1）原生质体活力
原生质体有活力是进行原生质体培养的基础。供试材料、酶类组合及酶解时间、渗透压稳定剂、质膜稳定剂、pH、光照、温度等都会影响原生质体活力。
2）原生质体起始密度
原生质体接种时的植板密度对再生细胞的分裂具有很大影响。过高或过低，都不利于细胞分裂。常用的植板密度为104～105个细胞／mL。但是，在原生质体培养的起始植板密度为104～105个细胞／mL时，由个体形成的细胞团常常在培养早期就彼此交错生长在一起，若不同原生质体群体在遗传上具有异质性，就会形成嵌合体组织。而起始植板密度如果低于103个细胞／mL，即使原生质体能进行细胞壁再生，细胞分裂能力也会受到严重影响，仅分裂1～2次。
3）渗透压稳定剂
在没有形成细胞壁前，原生质体的培养必须有培养基渗透压的保护。培养7～8天后，大部分的原生质体已经再生出细胞壁并通过几次细胞分裂形成了细胞团。此后，通过定期加入渗透压剂或渗压剂水平很低的新鲜培养基，逐渐降低培养基渗透压，最后将肉眼可见的细胞团转入不含渗压剂的新鲜培养基中。
4）培养基营养
原生质体培养常用的基本培养基为MS、B5、NT、N6、MT或它们的衍生培养基。无机盐浓度应低于组织或细胞培养的培养基，适当提高Ca2+、Mg2+含量而降低NO-3含量，有助于提高原生质体的稳定性，促进细胞分裂；生长激素的种类和组合因植物材料而异，一般由活跃生长的培养细胞分离的原生质体要求较高的生长素、细胞分裂素配比才能进行细胞分裂，而由高度分化的细胞（如叶肉细胞等）得到的原生质体，则需要较高的细胞分裂素／生长素配比才能进行脱分化。
为了使原生质体在低起始植板密度下能够进行分裂生长，高国楠和Michayluk（1975）配制了一种含有多种维生素、氨基酸和有机酸的培养基即KM8p，使单个原生质体或起始植板密度少于100个细胞／mL的原生质体培养获得成功，说明原生质体具有复杂的营养要求。(https://www.daowen.com)
5）培养条件
（1）光照
原生质体培养初期对光照要求严格，需要黑暗或微弱的散射光。一些对光非常敏感的物种，初期的原生质体培养应完全置于黑暗中，如显微镜下用加绿色滤光片的白炽灯照射5 min后，豌豆原生质体的有丝分裂活动就受到完全抑制。形成细胞团后，特别是诱导器官发生时，则须强光照射。
（2）温度
原生质体培养温度一般为24～30℃，但不同物种间差异较大。当培养温度低于25℃时，番茄叶肉细胞原生质体和陆地棉培养细胞的原生质体不能分裂或分裂频率很低；而在27～29℃下培养，原生质体发生分裂，植板率很高。
（3）植物材料和基因型
①植物材料。分离、纯化的原生质体能否在适宜的培养环境中形成细胞团和再生植株，与供试材料的生理状态密切相关。如在向日葵幼叶、子叶和下胚轴原生质体的培养时发现，只有下胚轴的原生质体培养后得到了细胞团和胚状体。
②基因型。不同基因型的原生质体再生植株形态发生能力不同。如用12个水稻品种的悬浮细胞培养细胞原生质体，只有4个品种得到了原生质体；在夫雷亚茄原生质体培养能力的遗传分析中发现，原生质体培养到形成愈伤组织受2个独立位点的显性基因控制。
