4.3.1　原生质体培养方法

原生质体培养类似于单细胞培养，培养方法主要有3种，即液体浅层培养法、固体薄层培养法和双层培养法。

1）液体浅层培养法

液体培养法是指培养基中不加凝胶剂，使原生质体悬浮在液体中进行培养的方法，常用的是液体浅层培养法。液体浅层培养法是将原生质体用培养液调整到一定细胞密度，取少许置于培养皿中浅层静止培养的方法。在培养期间，每天轻轻晃动2～3次，以加强通气。原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。当原生质体经细胞壁再生并形成细胞团后，应立即转入固体培养基上培养，以利于分化形成植株。

2）固体薄层培养法(https://www.daowen.com)

固体薄层培养法又称为平板培养法，是指将一定体积（3～4 mL）的原生质体按照一定细胞密度（104～105个细胞／L）与等体积的处于45℃的琼脂培养基混合，在培养皿内制成薄层（1 mm）固体平板的方法。这种培养方法使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动。优点是利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察，缺点是培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响，且单细胞生活力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2天左右。

3）双层培养法

双层培养法又分为液体-固体双层培养法和固体-固体双层培养法。将一定浓度原生质体悬浮液涂布在固体琼脂培养基表面的培养方法为液体-固体双层培养法。液体-固体双层培养法是固体薄层培养和液体浅层培养两种方法的结合，不仅具有液体培养法的优点，而且当液体培养基蒸发消耗完时，分裂的小细胞团会落在固体培养基上而被固定，细胞分散性好。将等体积的琼脂或琼脂糖与一定浓度的原生质体悬浮液混合，涂布在固体琼脂培养基表面的方法为固体-固体双层培养法。该法的优点是下层固体培养基中的营养物可以逐渐向上层释放，以备原生质体利用。缺点是原生质体较易缺氧，且固体培养基不利于原生质体的分裂增殖。此法已用于甘蔗和黄花烟草等植物的原生质体培养。

此外，用于细胞培养的一些技术，如悬滴培养、微室培养、看护培养等技术，也已在原生质体培养中得到了应用，特别是用于低密度原生质体培养。