5.2.3　外植体制备及接种

1）花粉外植体消毒

花药和花粉培养中的表面灭菌通常先用70%乙醇浸润花蕾30 s左右，然后在饱和漂白粉溶液中浸泡10～20 min，或在0.1%氯化汞溶液中处理5～10 min，之后使用无菌水漂洗3～5次。一般情况下，表面灭菌在能杀灭花蕾表面微生物的前提下，处理的强度以尽可能轻为好。

2）花粉外植体制备

花蕾经表面灭菌后，在无菌条件下剥取花药接种于培养基上。采用花药漂浮培养自然释放法和机械分离法制备花粉外植体。花药漂浮培养自然释放法的方法：把花药接种在加有Ficoll的液体培养基上，花药漂浮于液体表面经1～7天的培养，药壁开裂，花粉散落，过滤收集后接种培养。机械分离法经过分离、过筛和清洗3个步骤。(https://www.daowen.com)

①分离：把花药放在玻璃容器中，加入一定量适当浓度的蔗糖溶液或直接加入适量液体培养基，用注射器内径轻轻挤压花药，将花粉挤出。

②过筛：把花药残渣和花粉混合液经一定孔径的过滤网过筛。孔径大小据花粉粒的大小进行选择。一般孔径应比花粉直径大10μm左右。将带花粉的滤液注入离心管。

③清洗：把离心管中的液体置于100～1 000 r／min的速度下离心1～5 min。弃上清液，重新加入蔗糖溶液或培养基离心，弃上清液，重复2～3次。最后一次用培养花粉的液体培养基进行，以保证培养基成分的稳定性。最后，取出上清液加入适量液体培养基，使花粉的密度达到104～105个／mL。