7.3.3 超低温保存方法
1）预处理
为了保证茎尖在液氮处理后具有稳定且较高的存活率，需进行一定的预处理，或在冷冻防护剂存在下进行预培养，或直接进行低温（-3～10℃）预处理。例如，马铃薯新采集的茎尖若不在光下经过至少48 h的培养，冷冻处理后不能存活；麝香石竹茎尖经4℃低温处理14天，不仅可提高存活率，而且分化频率可由30%提高到60%；苹果和梨休眠芽在-3～10℃低温下预处理20天，可提高液氮保存后的存活率。预处理的作用表现：提高分裂细胞的比例；提高组织和细胞渗透压；防止细胞和组织冰冻。
预处理结束后，培养材料的温度被降至0℃或0℃以下，再加入0℃预冷的冷冻防护剂，然后进入冷冻降温。
2）冷冻处理
冷冻处理过程是冷冻保存效果的关键因素之一。冷冻处理的方法有快速冷冻法、慢速冷冻法、预冷冻法和干燥冷冻法4种方法。
（1）快速冷冻法
快速冷冻法是将植物材料从0℃或者其他预处理温度直接投入液氮中保存的方法。降温速度为1 000℃／min。植物体内水分在降温冷冻过程中，从-140～-10℃是冰晶形成和增长的危险温度区，-140℃以下，冰晶不再增生。这一方法的关键就是利用高速降温越过冰晶增长的危险温度区，使细胞内来不及形成大小可以致死的冰晶，避免细胞结冰。快速降温越过危险温度区后，细胞内水分会固化，形成“玻璃化”状态。这种状态对细胞是安全的，不会破坏细胞结构。采用快速冷冻方法保存植物材料，要求细胞体积小、细胞质浓、细胞含水量低、液泡化程度低的材料，如种子、花粉、球茎或块茎、耐寒的木本植物的芽、枝条、茎尖等。
（2）慢速冷冻法
慢速冷冻法是将处于0℃或其他预处理温度的材料以1～2℃／min的降温速度从起始温度降到-100℃，稳定1 h后投入液氮中保存或以此降温速度连续降温至-196℃的方法。此法适用于成熟的、含有大液泡和含水量高的细胞，对于悬浮细胞的保存特别有效。慢速冷冻法降温时需程序降温仪或计算机来控制降温器。
（3）预冷冻法
预冷冻法是指将植物保存材料放入液氮前，需经过短暂时间的低温锻炼的方法。又分为两步冷冻法和逐级冷冻法两种。两步冷冻法是将预处理后的材料先通过慢速冷冻法降温至-40℃，保存一段时间，约30 min后，再将材料直接投入液氮中保存的方法。保存过程的第一步采用1～2℃／min慢速降温法，使温度从起始温度降到-40℃，在此温度下停留一段时间；第二步将材料直接投入液氮中迅速冷冻。这种方法是目前比较理想的保存方法，在烟草、胡萝卜、水稻、玉米等多种悬浮细胞、愈伤组织、茎尖和芽的保存中得到了应用。草莓茎尖经快速冷冻后成活率为40%～60%，但若采用两步冷冻法，成活率可提高到60%～80%。逐级冷冻法是将预处理后的材料通过不同温度等级降温至-40℃，再投入液氮中保存的方法。此法是在无程序降温仪等设备下的保存方法。将保存液制备成不同温度等级的溶液，如-40、-35、-23、-15及-10℃，将经过预处理的材料逐级通过这些温度降温，并在每级温度中停留4～6 min，然后将材料投入液氮中保存。
（4）干燥冷冻法
干燥冷冻法是将材料置于27～29℃烘箱内降低植物含水量，再投入液氮中保存的方法。此法可防止材料冻死，如豌豆幼苗置于27～29℃烘箱中，含水量由72%～77%下降到27%～40%。浸入液氮后可全部免遭冻死。(https://www.daowen.com)
3）冷冻贮存
适宜温度下贮存冷冻材料也很重要。如果贮存期间温度高于-130℃，细胞内冰可能增长，造成细胞生活力下降。因此，长期贮存在液氮内的材料，需合适的液氮容器，如液氮冰；或液氮贮存罐等。理论上，只要保证不断补充液氮，维持冷冻温度，就可以长期保存冷冻材料。但研究发现，冷冻贮存的茎尖随保存时间的延长，其生活力可能下降，因此技术上还有待于改进。
4）解冻植物材料
在超低温贮存过程中所发生的冻害是在冷冻和解冻过程中产生的。解冻过程中发生的冻害是由细胞内次生结冰造成的，另外，解冻过程中水的渗透冲击也会对细胞膜体系造成破坏。解冻法有快速解冻法和慢速解冻法两种。
（1）快速解冻法
快速解冻法是指将液氮中保存的材料直接投入到37～40℃温水浴中进行解冻的方法，解冻升温速度为500～750℃／min。对-196℃下保存的材料进行解冻时，再次结冰的温度区是-50～-10℃。快速解冻法可以迅速越过再次结冰的危险温度区，使细胞免遭损伤。大多数植物材料可以利用此法进行解冻。
（2）慢速解冻法
慢速解冻法是将液氮中保存的材料先置于0℃以下解冻，再逐渐升至室温下进行解冻的方法。利用慢速解冻法可以使水分缓慢地渗入到细胞中避免因强烈渗透而造成水分对细胞膜的破坏。慢速解冻适合细胞含水量较低的材料，如木本植物的冬芽。
解冻方法的选择与冷冻方法有一定的关系，一般冷冻降温速度超过-15℃／min，解冻时宜采用快速方法，否则应采用慢速方法。解冻操作应十分小心，因为冰冻后的组织和细胞非常脆弱，极易产生机械损伤。试管内的冰一旦融化，应迅速转入20℃水浴，立即进行洗涤和培养。
5）再培养
再培养是指将已解冻的材料重新置于培养基上使其恢复生长的过程。再培养是检验冷冻保存效果或确定保存方法是否合适的最根本方法。冷冻保存时若加入冷冻防护剂，它对植物细胞有毒害作用，培养前应将解冻的材料进行多次清洗，去除冷冻防护剂。为避免质壁分离复原过程中对细胞造成伤害，冷冻防护剂的洗涤应逐步进行。经过解冻和洗涤后，应立即将保存材料转移到新鲜培养基上进行再培养。
再培养初期有一个生长停滞期，这是由于冷冻过程中细胞受到了不同程度的损伤或受冷冻防护等因素的抑制作用。再培养过程中，一般通过观察组织或细胞复活情况、存活率、生长速度、生长能力等指标进行保存效果的初步评价，还需对遗传性状进行分析来进一步评价保存效果，如形态发生能力、后代形态特征和生长发育状况、染色体、同工酶谱、抗性等。
