12.2.3　基于细胞不同黏附特性的分离纯化法

基于细胞不同黏附特性的分离纯化法主要有机械刮除法、酶消化法和反复贴壁法。

机械刮除法主要原理是在原代培养时，如果上皮细胞和成纤维细胞为分区成片混杂生长，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上，可采用机械的方法去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域。过程：将要纯化细胞的培养瓶在净化室内放在倒置显微镜监视下进行。用硅橡皮刮子在不需要生长的细胞区域推划，使细胞悬浮在培养液中，注意不要伤及所需细胞。推划后用培养液冲洗振摇2次并倒掉，即可将培养基加入原瓶继续培养。数日后如发现不需要的细胞又长出，可再进行上述操作，这样反复多次就可纯化细胞。(https://www.daowen.com)

酶消化法是比较常用的纯化方法，不仅对贴壁细胞可行，对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化也是十分有效的。利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两者分开，以达到纯化的目的，两者在胰蛋白酶的作用下，由于成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代细胞初次传代和早期传代中两种差别尤为明显，故可采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。

反复贴壁法的主要依据是利用细胞在生长过程中的贴壁速度不同。如成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞能在短时间内（10～30 min）完成附着过程（但不一定完全伸展），而大部分上皮细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，利用此差别可以纯化细胞。方法：将细胞悬液接种在一个培养瓶内（最好培养液内不含血清，此时上皮细胞贴壁更慢），静置20 min。在倒置显微镜下观察，见部分细胞贴壁，稍加摇动也不浮起时，将细胞悬液倒入另一培养瓶中，继续静置培养20 min，然后再重复上述操作后，即可将上皮细胞和成纤维细胞分隔开，在第1瓶和第2瓶以成纤维细胞为主，以后几瓶即以上皮细胞为主，下次传代时再按上述方法处理，就可使两者达到完全分开的目的。