13.2.3　tRNA介导的蛋白质改造

tRNA主要起转运氨基酸的作用。由于tRNA分子具有同工性，即一种以上的tRNA对应于一种特异氨基酸，因此细胞内tRNA的种类（80多种）比氨基酸的种类多。tRNA介导的蛋白质工程（tRNA-mediated protein engineering，TRAMPE）则允许拓展遗传密码，从而可以将人为设计的非天然氨基酸选择性地掺入蛋白质，产生具有新的或更好性状的蛋白质。利用TRAMPE进行的早期研究是基于对可以携带天然氨基酸的tRNA的化学修饰，现在称为非天然氨基酸替代（non-natural amino acid replacement，NAAR）法。该突变tRNA通过改变其反密码子能够识别并抑制终止密码子的链中止效应。这种方法允许蛋白质中特定的氨基酸由它们的衍生物来替代。随后，Noren等发展了定点非天然氨基酸替代（site-directed NAAR，SNAAR）的方法，在编码蛋白质的mRNA的特定位点上引入终止密码子，最后用互补的错氨酰化校正tRNA来通读越过此终止密码子，从而在蛋白质的特定位点掺入非天然氨基酸。利用天然氨基酸掺入技术，将特定的氨基酸掺入蛋白质肽链中的特定位点，这种修饰既能定性又能定量，同时一些传统修饰方法不能得到的衍生物，也可以通过该技术引入蛋白质的肽链之中。Sisido等列举了29种已经可以掺入蛋白质中的非天然氨基酸（图13-15）。

图13-14　交错延伸原理

（引自刘贤锡，2002）

生物体内共有20种氨酰tRNA合成酶，每一种均对应于一种天然氨基酸和一种tRNA类型，但是非天然氨基酸无相应的氨酰tRNA合成酶。目前已经发展了几种使tRNA被非天然氨基酸酰化的方法。

最简单的将非天然氨基酸和tRNA连接的方法是化学合成法。一种是用相应的氨酰tRNA合成酶氨酰化tRNA，使之携带天然的氨基酸，一旦共价键形成，即可以采用化学修饰的方法加入其他基团。第二种是化学法氨酰化，将非天然氨基酸氨酰化二核苷酸CA，然后通过T4 RNA连接酶连接到已去除3'端CA二核苷酸的tRNA上（图13-16（a））。两法相比较，酶促反应局限于天然的氨基酸及其类似物，而化学法可以氨酰化任何非天然的氨基酸。利用天然氨酰tRNA合成酶将一些氨基酸的类似物连接到原有tRNA是很少见的特例，但可改造原有的氨酰tRNA合成酶，使它们能识别一些非天然的氨基酸，而不再作用于天然的氨基酸（图13-16（b））。利用具有一定特异性核酶催化的转酶反应，将原来具有催化活性的RNA上的氨基酸转移到tRNA上（图13-16（c））。

图13-15　通过tRNA介导掺入蛋白质中的非天然氨基酸

（引自梅乐和，2011）

图13-16　非天然氨基酸和tRNA连接的方法

（引自梅乐和，2011）