实训九 清热药的体外抗菌实验
（一）目的
通过实验，掌握中药体外抗菌实验的方法，了解清热药对病原菌的抑制和杀死作用。
（二）准备
1.菌种 根据实验条件可选用大肠杆菌、沙门氏杆菌、肺炎双球菌、链球菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌，一种或数种。先接种在适于生长的培养基内，置于37℃恒温箱中培养24 h，待菌种复壮后使用。再取复壮的菌种一环，放在适宜的培养基内，置于37℃恒温箱中培养。培养时间及所需培养基因细菌的种类不同而异。一般细菌培养6h，菌液浓度相当于每mL 9亿左右，再用肉汤液1∶500稀释后使用。链球菌、肺炎双球菌等培养18 h，菌液浓度相当于每mL 3亿左右，再用肉汤液1∶5稀释后使用。
2.药物 清热药如黄连、黄芩、地丁、栀子等。将欲试药物制成100％中药煎剂（1∶1煎剂）。经高压灭菌20 min，冷却后置冰箱中备用。
3.培养基 一般细菌如葡萄球菌、肠道杆菌等，可采用普通肉汤培养基或普通肉汤琼脂培养基。链球菌、肺炎双球菌等对营养要求较高的病原菌，可采用羊血肉汤培养基。
4.器材 试管（高压灭菌后备用），接种环，酒精灯等。
（三）方法和步骤
1.试管法 用普通肉汤琼脂培养基或羊血肉汤培养基与100％中药煎剂进行倍比稀释（第一管双倍培养基），稀释度为1∶2、1∶4、1∶8……1∶256，每管量为1 mL。然后将菌液分别接种于不同浓度的药液培养基中，接种量为已稀释好的菌液0.1 mL。同时分别在试管中加入药液（药液与培养基1∶2）、细菌（细菌与培养基0.1∶1）、培养基（不加药液与菌液），各一管，作为对照。将上述试管摇匀后，置于37℃恒温箱中培养24 h，再观察结果。
2.平板法 先将药物按试管法稀释为1∶2至1∶256等不同浓度。取各稀释度的药液1 mL，置于无菌平皿中，然后在各平皿中加已溶化的琼脂培养基9 mL，使其迅速与药液混匀，对照选择10 mL琼脂培养基。已凝固的平板做标记后置于37℃恒温箱中1～2 h，使其水分干燥。取出平皿，将细菌以划线法接种于平板上，再置于37℃恒温箱内培养24 h后观察结果。(https://www.daowen.com)
（四）观察结果
1.试管法 首先在细菌对照管混浊，而培养基对照管、药物对照管澄清透明的前提下，再观察细菌试管的混浊情况，以判定不同浓度药液的抑菌作用，如试管内液体混浊，说明有细菌生长，用“+”表示；如试管内澄清透明，说明无细菌生长，用“一”表示，将观察结果记入下表。
如因药物色素较深，不易判断，可取一接种环将细菌移种于平板上，于37℃恒温箱内培养24 h再观察。
2.平板法 主要观察平板上有无细菌生长。注意应在观察对照平皿无细菌生长的前提下记录结果。观察和判断方法同试管法。
（五）分析讨论
将全班各组实验结果进行比较，如结果相近可计算平均值，如结果差别较大，应分析讨论其原因。
（六）作业
完成实训报告。
