融合现代医学的动物及细胞的模型建立方法
（一）基本建模理论
帕金森病（Parkinson's Disease，PD）是一种神经退行性疾病，PD主要发病原因是多巴胺能神经元的变性坏死致使脑多巴胺的严重亏损。迄今为止，全世界超过630万人受其影响，但却依然没有比较有效的方法可以阻止或延缓这种神经退行性变的过程。随着全世界人口老龄化，解决PD这一世纪顽症成为各国学者必须面对的任务。
为了更好地研究PD的发病机制及临床治疗，动物模型的制备成为必不可少的研究手段。在实验动物身上复制出类似人类PD的症状，对完成这项任务来说意义非凡。但因为其病因目前仍不清楚，所以开发合适的PD动物模型有助于更好地阐明的病因和研发有效的治疗药物。
目前，迫切需要临床相关的模型来研究帕金森病的发病机制，以促进帕金森病的治疗。帕金森病在动物中没有自发的倾向，进行PD实验研究需要建立适当的动物模型。制备PD模型的理论基础是基于对PD的病理和生化机制的认识。
该病病因复杂，病程缓慢，给研究其具体发生机制造成困难。目前希望建立一种更加接近人类早期帕金森病的动物模型，它更加接近人类早期帕金森病的临床表现、生理生化方面的改变，为临床研究提供更好的帮助。理想的PD模型可以模拟人类疾病的损伤分布及其随时间的变化，但目前并没有一个完美的模型能够完全模拟PD所有特征。这种帕金森病动物模型需要能够满足以下要求：
（1）该动物模型可以模拟人类帕金森病的病理、生化改变。
（2）该动物模型可以出现与人类帕金森病相似的临床症状，而且能够稳定的表达，不会自行恢复。
（3）可以模拟帕金森病患者对治疗的反应。
因此，在相关实验研究中，我们希望能够通过各种途径控制模拟PD形成原因、PD发生的机制、给药途径、给药部位以及实验动物的年龄、性别等因素，建立一个稳定的帕金森病动物模型，通过研究观察、对照参考、系统追踪、形态学观察、尸体解剖检查等实验方法对模拟动物模型进行研究分析。
近年来，实验动物研究的一个热点是实验动物人源化，期望通过实验动物人源化在一定程度上提升动物模型与人类疾病的相似性。因此，建立PD动物模型有助于阐明PD病因和发病机制，在新的治疗方法和药物研发中具有重大的应用价值。
（二）常用建模方法
随着PD的相关研究，越来越多的研究人员采用建立实验动物及细胞模型的方式更好地开展研究。从1968年Ungerstedt等首先报道了利用6-羟基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）制作成功PD动物模型，到如今应用基因工程技术建立动物及细胞模型，建模方法越发丰富，手段越发高强，实验效果也越发接近临床。PD相关动物模型种类多样，发展迅速。不同种类的PD动物模型，为研究PD相关作用机制及治疗手段提供了有力帮助。
PD动物模型使用动物种类广泛、多样。其具体大致分为四类，包括啮齿类、灵长类、其他哺乳动物（小型猪、犬、猫）和其他动物（秀丽隐杆线虫、果蝇、斑马鱼）。啮齿类动物在神经毒素模型中使用最为广泛，是经典的造模动物种类。其优点主要为：
（1）大小适中，其解剖结构与临床症状与PD患者最为相似。
（2）饲养条件简单，成本较低。
（3）操作最为简单，伦理问题较少。
PD动物模型使用方法多种多样，如应用神经毒素诱导创立动物模型，应用高科技基因工程技术模拟建立其模型等。
在实验动物及细胞模型建立中，常用到以下几种建模方法。
1.动物模型建立方法
神经毒素诱导的动物模型：神经毒素模型是最早使用在PD研究中的动物模型，也是目前最常用来评价PD治疗效果的手段之一。经典的PD动物模型即为神经毒素模型，主要针对多巴胺信号，导致选择性黑质多巴胺神经元变性，模拟PD大部分的病理和表型特征。该类模型较其他模型优势明显，以其相对简单的操作与较低的成本，受到了研究者的青睐，在实际研究中使用较为广泛。该类模型大多适合研究黑质、纹状体内多巴胺能神经元的退行性变化过程及治疗手段的恢复进程，治疗目标为恢复有效的多巴胺功能而缓解症状。
6-OHDA和MPTP都是儿茶酚胺神经毒素，广泛用于啮齿类、树鼩、非人灵长类动物等PD模型的创建及相关病理机制研究。
6-OHDA模型
6-羟基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）是一种神经毒素，易受SOD抑制，形成6-羟多巴胺奎宁和过氧化氢（H2O2）、超氧化物基、羟基自由基等有强氧化电位的物质，对神经产生毒性作用。因其造成动物的生物化学和神经化学损伤类似于PD，故常被用于诱导动物PD模型。
6-OHDA作用机制为其在结构方面与DA相似，容易被误作为神经递质，摄入到神经元内，形成羟自由基，引发氧化应激以及对线粒体氧化呼吸链抑制等问题，从而造成DA能神经元死亡。但6-OHDA不能透过血脑屏障，只能经脑内给药。使用该物质时，不同的注射方式、给药部位通常会产生不同的病理变化与临床症状。常用来研究的试验方法为制造单点多量模型、多点常量模型等。
6-OHDA模型的优势为仅诱导一侧大脑半球的神经变性，致对侧身体的行为学症状，可更好地评估其运动障碍及药物治疗效果。6-OHDA单侧损毁制备的旋转模型是目前用得最多的PD模型之一，其病理、生化方面的表现同人类PD有不少相似之处。其缺点是该模型仍属急性损伤模型，不能模拟PD慢性进行性病程特点，病理方面也与人类PD有一定差异（如无细胞内路易小体）。此模型可用于PD的发病机制及药物疗效判定、细胞移植治疗、基因治疗、神经保护等治疗方面的研究。
MPTP模型
1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-Methyl-4-Phenyl-1，2，3，6-Tetrahydro pyridine，MPTP）可直接损伤多巴胺能神经元，能较好地模拟症状和发病过程。MPTP在20世纪80年代因导致人类PD而被认知，之后便很快被用来诱导PD动物模型。MPTP本身没有神经毒性作用，它诱发PD的机制是MPTP穿过血脑屏障作用于神经胶质细胞，后者产生的MPP+作用于多巴胺能神经元，造成损伤或坏死而导致PD的永久性症状。
MPTP模型是最常用的PD模型，MPTP模型不仅能复制PD的行为学症状，还能准确模拟黑质纹状体系统的退行性变。另外MPTP模型可影响肠道DA神经系统致结肠蠕动障碍，而消化功能障碍是PD患者早期的主要症状。MPTP模型对于研究PD线粒体功能障碍的实验也较有价值。
常用来构建模型的方法有非人灵长类动物双侧PD模型、非人灵长类动物偏侧PD模型、猫PD模型等，从目前的实验看来，非人灵长类如猴对MPTP敏感度高，小鼠对MPTP的敏感性次之，大鼠对MPTP敏感度不高，但MPTP引起的病理改变与人类PD非常类似，所以用MPTP小鼠造模是应用普遍PD模型。此外，不同注射方法也会导致不同的临床现象。单次高剂量脑内注射或重复低剂量腹膜内注射，通常会导致黑质纹状体产生明显的多巴胺能神经元病变及较为显著的运动症状，而低剂量注射，则可观察到渐进性多巴胺能神经元的损伤与相应的运动症状。
该模型最大的特点为：病程渐进且与PD患者临床症状最为吻合；可观察到突触核蛋白沉积现象，而这一特点是目前大多数PD动物模型所不具有的。对比而言，小鼠敏感性较好，并且由于小鼠饲养条件简单，成本较低且操作简单，故MTPT小鼠模型使用最为广泛。不论是何种剂量，MTPT导致的运动症状一般是可通过行为学标准进行评估。MPTP模型适用于PD药物的研发和研究。
鱼藤酮模型
鱼藤酮是一种由热带植物提取而来具有细胞毒性的物质，它被广泛用作杀虫剂。鱼藤酮被认为是“安全无害”的农药，具有高度的亲脂性，可透过血脑屏障，与MPTP物理特性类似，在脑组织内激发脂质过氧化产物，对神经细胞产生毒性作用。
因其很容易到达相应器官并进入细胞，在脊椎的动物中主要造成多巴胺能神经元的损伤或坏死，由此可以成为研究PD早期阶段周围神经系统病理的模型。同时，优化鱼藤酮模型，探索一种更加模拟症状的动物模型对研PD的新药将会起到积极推动作用。
不同的给药途径和不同部位的给药也会引发不同的效果，常用的给药方法主要有皮下注射、腹腔注射、口服/胃内给药、立体定位注射、静脉注射、吸入/鼻内给药等。主要研究观察方法为对脑组织进行免疫荧光、免疫组化与蛋白印迹等检测进一步印证实验。
用鱼藤酮制作PD大鼠模型的特点是：能够在系统性误差内诱导多巴胺能神经元的损伤或缺失，其模型的黑质区可出现DA神经元变性和胞质内路易小体的形成，能更好地模拟人类PD的发病机制，是一种具有独特优势的PD动物模型。鱼藤酮模型最大的缺点是其全身性毒性作用，主要影响心血管系统。由于其亲脂性高，在高剂量鱼藤酮造模时，动物受全身毒性作用的影响容易出现与PD无关的表现，例如心血管毒性和非特异性脑损伤等，且模型具有较大的个体差异性。除此之外，其需采用费用昂贵的微渗透泵皮下埋植给药，经腹腔和皮下注射的方法模型，成功率低。(https://www.daowen.com)
综上所述，鱼藤酮模型虽有一定的局限性，但在探讨帕金森病发病原因和发病机制方面，仍具有很大的潜力。而且，鱼藤酮模型被证明能成功的用于测试新型神经保护策略逆转或减缓疾病的进展。但是应该强调一点，在将来的研究中，研究者应该仔细选择物种和方法以及鱼藤酮处理剂量，使用鱼藤酮动物模型解决在帕金森病研究领域许多悬而未决的问题。
基因工程技术模型：随着基因技术的逐步推广与深入，基因技术造模研究的深入开发与应用在诸多疾病的机制研究中发挥了重要作用。近年来，越来越多与PD相关的遗传因素被发现，迄今为止，已经鉴定了15个致病基因和超过25个遗传风险因子。研究者通过使用遗传学的相关方法，对特定物种进行PD相关基因修饰，可制造出与PD相关的转基因动物模型。目前常用的制备手段主要为基因敲除与转基因技术。
基因敲除模型的建立为探究PD的病理过程开创了新的思路，但并不是全部的动物基因敲除模型都会出现与人类相似的PD典型病理特性以及行为学改变。同时在人类PD中出现的异常基因，反而在小鼠中正常表达。基因敲除模型为相关人员研究确切的分子机制提供了研究工具，这些模型的早期症状学提供了靶向功能障碍途径的可能性。
转基因模型主要是基于家族性PD相关基因的发现，其为常见且广泛使用的神经毒素的模型提供了替代方案和补充。
PINK1基因敲除模型
PINK1基因的表达产物是一种蛋白激酶（PTEN Induced Putativekinase 1，PINK1），能在整个机体的细胞内表达，在耗能高的器官里的表达尤为突出。在细胞内，PINK1主要位于线粒体的内膜中。有研究表明，PINK1能够介导自噬过程，在正常的线粒体中可以迅速降解，但在受损的线粒体中会大量累积，从而触发自噬。与此同时，从研究PINK1的结果显示，这种蛋白质参与心脏损伤的线粒体质量控制。在安静状态下，PINK1敲除细胞和PINK1细胞的氧化磷酸化链受损，导致线粒体膜电位下降。线粒体靶向的PINK1基因的突变会导致PD。因此，在通过敲除PINK1基因的方式造模成功后，可以对细胞自噬相关蛋白采用蛋白印迹检测、基因的表达检测等方法进行分析，以验证实验结果。
DJ-1基因敲除模型
DJ-1基因编码的蛋白作用广泛，可参与基因转录调节、氧化应激、线粒体功能调节等活动。该基因突变会造成氧化应激反应功能紊乱，导致常染色体隐形PD。不同动物类型的该基因敲除模型具有显著差异。如小鼠模型通常表现出中度运动障碍，且未见多巴胺能神经元坏死，而大鼠模型通常会表现为黑质纹状体区域神经元坏死、缺失，并伴有运动功能障碍的临床症状。其具体作用机制目前尚未研究清晰，该模型多用于PD基础研究。
SNCA转基因模型
SNCA是第一个被发现与家族性PD相关的基因，其编码的蛋白是α-突触核蛋白，这是一种在中枢神经系统突触前及核周表达的可溶性蛋白质，也是PD患者神经元内出现的一种蛋白包涵体结构路易小体（Lewy body）的主要成分。全基因组关联研究表明SNCA与PD发病密切相关，SNCA与PD的相关性促进了基于内源性SNCA基因敲除的多种动物模型人突触核蛋白基因的过表达。SNCA基因高表达是PD的一个重要的病理学标志。采用转基因小鼠模型，可以对SNCA过表达对黑质中基因表现的影响进行评价。
2.细胞模型
SH-SY5Y细胞模型
SH-SY5Y细胞是人骨髓神经母细胞瘤细胞株，衍生于人的神经母细胞瘤细胞系SK2N2SH，它可以表达儿茶酚胺能神经元特有的酪氨酸羟化酶、多巴胺羟化酶和多巴胺转运体。近年来，SH-SY5Y诱导的PD模型被用作研究PD的重要工具。
SH-SY5Y细胞在含10%胎牛血清DMEM/F12培养液中，于37℃饱和湿度、5%CO2条件下培养。取对数生长期细胞进行实验。将细胞分为正常组、溶媒组、鱼藤酮组。消化细胞配制成密度为6×104/mL的细胞悬液，种于96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，每组6个复孔，当细胞贴壁、汇合度达70%～80%时，鱼藤酮组分别加入终浓度为0.15μmol/L、0.25μmol/L的鱼藤酮；溶媒组加入终浓度为0.0125%的DMSO，正常组不加药物。分别于给药24小时、48小时后采用MTT法测算细胞存活率，倒置显微镜观察细胞形态。
PC-12细胞模型
PC-12细胞株来源于一种可移植的鼠嗜铬细胞瘤，是常用的神经细胞株。以1-甲基-4-苯基（MPP+）处理PC-12细胞造模为例，建立PD模型。
3.其他模型建立
除草剂PD模型
除草剂百草枯在农业生产中被普遍应用，其化学结构与经典帕金森造模剂MPTP及其活性代谢产物MPP+非常类似，所以其神经毒性作用也与MPTP类似。研究报道，百草枯的暴露是造成帕金森病或影响其自然病程的重要因素，如百草枯在饮用水、食物中的残留，通过口腔进入人体。国内外实验通过在脑内、腹腔或皮下注射百草枯构建帕金森病小鼠、大鼠模型，但这与人类通过口服接触百草枯方式相差甚远。因此某些除草剂可用来制作PD动物模型。
目前，通过大鼠口服百草枯建立PD大鼠模型，将百草枯剂量分成20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg高中低剂量组和生理盐水的对照组，通过对SD大鼠持续灌胃4个月后，与对照组比较中，剂量组大鼠出现明显的反应迟钝、肌肉僵硬、震颤、中脑黑质DA神经元明显变形，纹状体中的多巴胺含量下降，实验通过口服百草枯可构建具有典型PD行为学特征的大鼠PD模型，这将为帕金森病的研究提供一个理想的动物模型。
遗传学模型
在PD人群中占少数的家族性PD病例，其遗传因素起关键作用，目前至少已发现两个家族性PD致病基因，包括α-synuclein和Parkin。其可表达与PD发病有关的野生或突变基因的转基因动物，可作为PD遗传模型，用于相关致病基因的致病机制、环境因素与遗传因素的相互作用等方面的研究。但制备过程复杂、技术要求高、费用昂贵是其缺点。
拟胆碱制剂模型
拟胆碱制剂通过抑制胆碱酯酶减少ACh的代谢或作为激动剂直接兴奋ACh受体，增强基底节ACh系统的功能，可制备以震颤为主要表现的PD模型。这类模型缺乏PD的病理基础，在代表性和稳定性方面不够理想，目前已基本不用。
机械损伤模型
目前在相关实验中机械损伤MFB后，导致黑质内DA能神经元因缺乏神经营养因子而死亡。1995年，Brecknell等利用切断MFB建立了机械损伤PD模型。
该方法优点：
（1）成功率高，成本低，较为经济。
（2）黑质DA能神经元呈现一个渐进性死亡的过程，可以模拟PD病理变化的全过程，对于研究如何预防PD以及神经元再生有一定意义。
缺点：
（1）术后不能准确把握损伤程度。
（2）建立该模型观察的时间周期太长。
免疫损伤模型
目前有报道称大多PD患者存在体液或细胞免疫异常，免疫因素可能参与DA能神经元的损伤机制。免疫因素可能参与DA能神经元的损伤机制。因此，可通过免疫因素的影响建立动物模型。
随着研究的深入开展，越来越多的相关模型被制作，用以寻找合适的帕金森病治疗靶点和研究发病机制。人类想要具体揭开PD发病的机制，彻底治疗PD，首先要构建出能完全与人类PD发病机制一样的动物模型。虽然各种PD动物的研究模型提供了新的见解，但目前来说各种造模方法都有其优缺点。目前为止，仍然缺乏一个十分理想的、能完全模拟临床PD症状、病理改变和病程变化的动物模型。
以上这些PD动物及细胞模型从不同角度、不同作用机制模拟PD的发生，但不可否认的是，PD患者所表现出的病变与症状与动物模型所反映的仍存在现实差异。因此，我们应该着眼于具体研究所使用的PD动物模型的有效性与结果的可重复性。与此同时，如何通过新兴研究技术，使PD动物模型最大程度贴合PD患者的临床症状就是我们研究的主要目标。模拟出一个具有所有病理和表型特征的动物模型，是一个有待解决的问题。同时，实验者也可根据不同的研究目的来选择合适的建立PD动物模型的方法。