相关动物及细胞的模型建立成果
（一）联合移植神经干细胞和小胶质细胞治疗帕金森病动物模型
1.小胶质细胞培养、分离、纯化与鉴定
取新生24小时内SD大鼠，在立体显微镜下取出大脑半球皮质，去除脑膜、血管和脉络膜，经胰酶处理后制成单细胞悬液，在含血清的小胶质细胞培养基中混合培养14～21天，采用拍打法和胰酶消化法分离小胶质细胞，差速贴壁法进行纯化，纯化的小胶质细胞进行CD11b细胞免疫荧光染色鉴定，观察小胶质细胞纯度。
2.结论
（1）胚胎NSCs能够在体外培养，传代后的NSCs可以分化为神经元和神经胶质细胞。NSCs与小胶质细胞联合体外培养能促进NSCs向DA神经元分化。
（2）在6-OHDA模型大鼠脑内原位联合移植NSCs和小胶质细胞，能够改善PD大鼠的运动功能。
（3）移植后的PD模型大鼠脑内TH表达增多，TH阳性细胞增多，说明联合移植的细胞能够在6-OHDA模型PD大鼠脑内存活并分化为DA神经元，DA神经元与PD大鼠的运动功能改善关系密切。
（二）遗传技术对帕金森病大鼠治疗效果研究
PD是由中脑黑质多巴胺能神经元进行性缺失造成的，本研究通过对大鼠的行为学评价、形态学评价来判断造模是否成功，红色荧光表明，携带感光蛋白基因的载体病毒在大鼠SNc成功表达。实验组与模型组大鼠δ、θ、β波的LZ复杂度高于空白组和病毒组，而α波的LZ复杂度低于空白组及病毒组。实验组与模型组大鼠为PD大鼠，脑内的直接通路和间接通路的平衡被打破，脑网络连接出现紊乱。在光刺激时，实验组大鼠表达在残余多巴胺能神经元上的光敏感通道蛋白被激活，多巴胺能神经元兴奋释放更多的多巴胺神经递质，使脑内多巴胺能神经递质的浓度接近正常水平。因此，δ、θ、α、β波的LZ复杂度更加接近空白组；光刺激结束后，随着时间的推移，脑内多巴胺神经递质的浓度降低，各波段的LZ复杂度逐渐恢复到光刺激前。病毒组大鼠属于正常大鼠，目标脑区神经元细胞膜上存在光敏感光蛋白，脑内的多巴胺神经元的数量并未减少。因此，在光刺激中，多巴胺能神经元释放更多的神经递质，异常放电更显著，各波段的LZ复杂度与实验组和空白组比较差异有统计学意义。模型组和空白组大鼠神经元并未表达感光蛋白，所以光刺激对模型组与空白组大鼠几乎无影响。
光刺激治疗对导入病毒的大鼠脑电信号有较明显的影响，实验组大鼠光刺激时，δ、θ、α、β波的LZ复杂度更接近空白组，对未导入病毒大鼠的脑电信号几乎无影响；光刺激实验组大鼠时，大鼠脑电信号θ波更加趋近于正常大鼠（即空白组的大鼠），提示光遗传技术对帕金森病有治疗效果。
本研究通过在PD大鼠致病脑区SNc立体定位注射腺相关病毒侵染残余多巴胺能神经元，用激光刺激表达在多巴胺能神经元上的光敏感通道蛋白来控制多巴胺神经递质的释放，用脑电分析验证光遗传技术对帕金森病的治疗效果。研究结果表明，PD大鼠脑电信号与正常大鼠有差异，光刺激治疗时PD大鼠脑电信号接近正常大鼠，光遗传技术对PD有一定的治疗效果。本研究实验结果与理论预想结果有一定的偏差，可能有以下两点原因：一方面，本实验在激光刺激的参数上研究不够深入；另一方面，脑电信号采集是在普通的脑电信号采集室进行，大鼠运动以及噪声对脑电干扰较大。在接下来的研究中，会重点研究光刺激治疗PD的相关参数，寻找最优的光刺激参数，在脑电信号采集时尽可能在屏蔽室做到干扰屏蔽，为光遗传技术治疗PD提供可靠、有效的理论支撑。
（三）嗅鞘细胞移植治疗帕金森病动物模型的相关研究
目的是利用大鼠同种异体嗅鞘细胞移植的方式，对帕金森病模型大鼠进行治疗，初步探究在PD模型大鼠脑内移植嗅鞘细胞能否成为治疗帕金森病的一种有效手段。方法提取和培养原代OECs，利用6-OHDA两点注射法建立帕金森病动物模型，通过APO诱导方式验证模型及检测治疗效果，通过HE染色进行大鼠黑质细胞形态学观察，利用抗TH荧光染色细胞计数对比治疗前后TH阳性神经元表达情况差异。结果从嗅鞘细胞移植后的第4周开始，PD模型的行为学诱导旋转圈数明显减少。HE染色结果示：PD模型大鼠毁损侧的黑质致密部的神经元变性明显，且TH阳性神经元数量降低，经OECs治疗后的帕金森病模型大鼠的患侧黑质部位神经元变性改善，且TH阳性神经元含量明显增高。结论表明，嗅鞘细胞能够改善帕金森病模型大鼠的行为学变化，嗅鞘细胞能够提高帕金森病模型大鼠患侧黑质部位多巴胺神经元含量。
帕金森病是常见的神经内科病，因其发病率较高，帕金森病一直受到神经科医生以及社会各界的广泛关注。PD的确切病因尚未明确，当前已知遗传、环境、年龄、氧化应激等均为其可能的发病机制。目前人类无法将帕金森病完全治愈，多国研究学者都将研究热点放在了细胞移植治疗上，希望通过细胞移植的方式，来补充帕金森病患者脑内缺失的多巴胺。20世纪80年代，学者们开始探究帕金森病的移植治疗，虽然可供移植的细胞多种多样，但是每种选择均具有各自的优点及不足。嗅细胞存在于嗅觉系统，它具有能够终身不断分化、生长、更新、再生的能力，因此它也属于一种特殊的神经干细胞。而且嗅鞘细胞还兼具星形胶质细胞和施万细胞的表型特征，所以，它具有表达神经生长因子、多种神经营养因子、脑源性神经营养因子等以及它们的受体的能力。因为其具有以上神经因子的功能，嗅鞘细胞可以帮助受损的轴突生长以及髓鞘再生，嗅鞘细胞且有容易获得、可自体移植等优点，所以它受到许多学者的青睐，并且已经应用于临床治疗脊髓横断损伤。虽然现在嗅鞘细胞移植治疗脊髓横断损伤已经属于较成熟的手段，但是嗅鞘细胞向脑内移植的安全性及疗效，相关的研究较少，故开展本实验。下面是该实验的过程及方法：
1.材料和方法
（1）大鼠嗅细胞分离及鉴定：50只清洁级成年雄性Wistar大鼠，取出嗅球组织经过处理制成细胞悬液，用细胞生长培养液将其浓度调整为5×105/mL、接种，应用免疫荧光染色进行细胞鉴定。
（2）帕金森病动物模型的建立及嗅销细胞移植的操作方法：24只健康成年雄性Wistar大鼠，随机选择18只大鼠进行PD模型手术，定为实验组，其余6只为对照组。实验组大鼠术前腹腔注射阿扑吗啡诱导，确定其均无异常的旋转行为。利用脑立体定位仪定位至前脑内侧纵束的位置（两点注射法：X：-2.5mm，Y：+1.8mm，Z：+7.5mm；X：-2.5mm，Y：+1.8mm，Z：+8.0mm）。用微量进样器在以上两点各注射6-0HDA4μL，共8μL（浓度为4μg/μL，含0.02%维生素C防止6-OHDA氧化）。注射速度为1.0μL/min，注射完毕后，留针5分钟，防止大鼠出现颅内高压，注射完毕后，用吸收性明胶海绵填塞骨孔并止血，缝合切口，常规消毒、腹腔注射青霉素避免感染。对照组：对照组大鼠应用与上述相同的手术方法，将6-0HDA换为等量的灭菌生理盐水（含0.02%维生素C），用于实验对照。
（3）帕金森病模型大鼠行为学检测：在造模手术后的第1周、第2周、第3周、第4周，分别对实验组及对照组进行阿扑吗啡诱导试验，大鼠旋转行为应符合以下标准：旋转时，以健侧左侧后肢为支点原地旋转，身体屈曲，首尾相接360°视为一圈，30分钟内旋转总圈数大于210转，即平均每分钟旋转大于7圈者为成功模型。
（4）PD模型的治疗及治疗后的检测：将已获得的PD模型随机选择一般数量进行OECs移植治疗，剩余半数则为PD模型组，治疗组应用造模时的相同方法，向大鼠前脑内侧纵束注入OECs（5μL），PD模型组：手术方法同治疗组，将细胞悬液换成等量（5μL）的不含OECs的细胞培养基。在细胞移植之后的第2周、第4周、第6周和第8周时，分别对OECs治疗组、PD模型组腹腔注射阿扑吗啡（0.5mg/kg）诱导，并连续观察30分钟，记录旋转圈数。
（5）免疫组化染色：取PD模型组、治疗组及对照组大鼠的脑组织，取黑质-纹状体部位做TH免疫组化染色，选取最接近黑质致密部位置的切片，不同大鼠所挑选片子的层面尽可能相同。TH染色前先行HE染色：在显微镜下观察染色后的细胞形态，并采集组织图像。而后进行TH抗体的免疫组化染色。观察染色后的切片，在400倍放大下随机选取5个位置，进行黑质部位TH表达阳性的细胞计数，并取其平均值，最后进行图像采集与分析。
（6）统计学方法：所得数据录入SPSS19.0进行运算，采用成对t检验对比治疗前后PD大鼠行为学诱导旋转圈数的差异，以及两组之间免疫组化染色高倍镜下细胞计数的差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.实验报告
（1）嗅鞘细胞的获取及鉴定：来源于嗅球的OECs贴壁于12孔板中。通过p75因子免疫荧光染色以鉴定嗅鞘细胞，通过p75染色，并结合Hoechst33342复染核，最终鉴定所获得的细胞为嗅鞘细胞。
（2）建模的成功率：在造模后第4次诱导时，共获得成功PD模型12只，成功率为66.7%，而对照组的6只大鼠在诱导时始终不发生旋转，成功的12只帕金森模型大鼠选为PD模型组。术后的第3周，是本实验造模成功的高峰，随后大鼠诱导旋转圈数趋于稳定；从12只PD模型组大鼠中随机选取6只为治疗组。
（3）OECs移植治疗对大鼠行为学的影响：细胞移植手术后的诱导结果：OECs治疗组与PD模型组同时间诱导结果相比较，第4周、第6周、第8周的旋转圈数明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。
（4）大鼠脑组织切片HE染色及免疫组化结果：PD模型组HE染色可见神经元坏死、缺失，黑质致密部的细胞数目减少，黑质细胞色素颗粒脱失、染色加深、细胞萎缩、神经元胞浆染色较浓，而对照组的黑质神经元形态学变化不明显。接受OECs移植后的治疗组，神经元损伤特征减少，细胞肿胀、坏死现象较PD模型改善明显，结合行为学表现，可见其帕金森病变得到有意义的缓解。TH免疫其帕金森病变得到有意义的缓解。TH免疫组化染色在400倍数高倍视野下进行细胞观察与计数，每张切片随机选取5个视野进行计数，计数结果取平均值。与对照组相比，PD模型组的大鼠相比TH阳性神经元的计数明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。而OECs治疗组，黑质部位TH阳性的神经元数目比PD模型组明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05），同时结合其行为学表现，可见其帕金森病得到有意义的缓解。
帕金森病是一种慢性的、不断进展的神经系统退行性疾病，它的典型病理特点是黑质及黑质纹状体通路的多巴胺能够发生神经元退变。但是，目前无论通过哪种药物都无法延缓疾病的变化，最终失去疗效甚至产生比较严重的副作用。有的学者们考虑通过移植多巴胺能神经组织，来补充帕金森病患者脑内所缺失的多巴胺能神经元。但是帕金森病的发病部位主要局限在中脑的黑质纹状体区域，患病部位较确切，所以该疾病比较适合利用细胞移植的手段进行治疗，补充其缺失的多巴胺才是首选的治疗方法。嗅鞘细胞来自嗅觉系统，它是一种在施旺氏细胞与星形胶质细胞之间的特殊类型的胶质细胞。它能够不断分化、生长，终身不断更新、再生，它也是一种特殊类型的神经干细胞，所以嗅鞘细胞能够帮助受损的轴突生长以及髓鞘的再生过程；再者，嗅鞘细胞还能够对轴突生长起着重要的作用。最新研究发现，嗅鞘细胞能够改善神经损伤区域及其周围的微循环，并促进微血管的生长。嗅鞘细胞能够使皮质脊髓束受损的轴突伸长、生长，并且还可以提高其神经行为学表现。这些特性均说明OECs具有很强的神经修复的功能。本实验得到的结果从神经行为学、细胞形态学以及解剖学的角度，非常全面地探究了嗅鞘细胞移植治疗帕金森病模型大鼠的治疗效果，实验结果证明嗅鞘细胞确实能够改善帕金森病的症状及病理变化。这些治疗结果有可能归功于嗅鞘细胞的强大的神经营养功能及神经修复功能。当大鼠的脑内发生帕金森病变时，通过细胞形态学观察发现，多巴胺能神经元变性坏死非常严重，因此失去了神经活性，从而导致了脑内产生的多巴胺含量急剧减少，这是产生帕金森病相关症状的病理基础。当OECs移植入大鼠脑内后，它通过自身分泌的大量神经生长因子以及层粘连蛋白等多种轴突生长所需要的营养物质，使神经元受损的轴突重新髓鞘化。因此，使得PD大鼠脑内已经变性的多巴胺能神经元发生逆转，再次具有神经活性，能够分泌大脑所需要的多巴胺，从而改善了帕金森病的病理进程。在细胞形态学角度表现为细胞变性、坏死情况的明显改善，解剖学角度则表现为TH阳性神经元数目的明显增多。由于补充了缺损的多巴胺，大鼠脑内的多巴胺受体敏感性下降，APO诱导产生的旋转行为出现了非常明显的缓解，具体表现为旋转圈数的明显下降。
（四）鱼藤酮致帕金森病动物模型研究
人们对帕金森病的发病机制尚未完全清楚，流行病学调查发现，接触杀虫剂的人群有多发帕金森病的迹象，现已公认鱼藤酮作为一种杀虫剂可用来制作帕金森病模型。就鱼藤酮损伤的帕金森病动物模型研究进展进行论述，为进一步探讨帕金森病发病机制提供参考。帕金森病的病理特征是细胞内蛋白质的包裹体路易小体（Lewy body）和营养障碍性神经突，主要是由突触前蛋白α-突触核蛋白的折叠错误和聚集及黑质多巴胺神经元丢失引起。黑质多巴胺神经元的丢失导致背侧纹状体突触末端的多巴胺水平显著降低，最终导致黑质纹状体通路的缺失。纹状体多巴胺的减少会引发一系列的运动症状，包括运动迟缓、静止性震颤、姿势障碍和僵直，这些都是帕金森病运动障碍的共同特征。结合目前已有的文献，对鱼藤酮帕金森病动物模型的研究现状进行简要的描述。(https://www.daowen.com)
1.鱼藤酮
鱼藤酮，是一种众所周知的线粒体复合物Ⅰ抑制剂。与其他神经毒素如6-泾多巴胺、MPTP和百草枯不同的是，这种毒素具有高度的亲脂性，就是比较容易越过血脑屏障，不需要任何转运体就能够进入多巴胺能神经元。鱼藤酮诱导的帕金森病神经毒素模型，是最近研究的其他神经毒性药物之一。鱼藤酮模型对人类帕金森病发病机制中观察到的大部分病理特征进行了概括，其中包括黑质致密部中多巴胺神经元的缺失，以及在黑质纹状体的多巴胺能通路中增强的氧化应激和神经炎症。
2.不同部位给予鱼藤酮致帕金森病动物模型
（1）口服/胃内给药：鱼藤酮已经通过口服给药测试，剂量从0.25～100mg/kg不等。通过给小鼠摄入30mg/kg，28天的鱼藤酮，显著导致黑质中约30%的酪氨酸泾化酶（多巴胺合成的限速酶）阳性神经元丢失。当该处理延长至56天时，在存活的酪氨酸羟化酶阳性神经元中，出现了更严重的酪氨酸泾化酶细胞损失（约60%），并增加了α-突触核蛋白的表达；这些变化与观察到的运动损伤同时发生。较低的浓度或无效或导致高度可变的酪氨酸泾化酶阳性神经元丢失，而浓度较高的100mg/kg会导致存活率低，且个体间的反应高度变化。
（2）腹腔注射：对大鼠腹腔注射鱼藤酮（2mg/kg，4周），发现鱼藤酮处理的大鼠产生典型的帕金森病症状、体重减轻和行为障碍，同时多巴胺的水平显著降低。在2个月内腹腔注射鱼藤酮［1.5μg/（kg·d）和2.5mg/（kg·d）］会使纹状体和前额叶皮层的多巴胺减少，纹状体酪氨酸羚化酶的免疫反应活性降低。这些数据表明，鱼藤酮能够引起大鼠多巴胺变性和诱导帕金森病症状。相反，腹腔注射低剂量的鱼藤酮［2.0mg/（kg·d），5d/周，6周］不会导致运动/行为缺陷或黑质纹状体多巴胺神经元病变。然而，腹腔注射鱼藤酮却引起胃肠运动神经病理和功能障碍（帕金森病在肠道神经系统的延迟出现和胃肠运动的相关功能障碍），这是帕金森病动物模型的主要非运动症状。
（3）皮下注射：将Sprague-Dawley大鼠皮下注射鱼藤酮（溶于葵花油）28天，可见黑质致密部显著的α-突触核蛋白阳性聚集。确定Wistar大鼠每日皮下注射鱼藤酮（2mg/kg）能促进α-突触核蛋白形成和重现帕金森病的典型特征，并保持低死亡率。另有科研工作者对Sprague-Dawley大鼠皮下注射鱼藤酮［1mg/（kg·d）］42日，要求能使大鼠出现帕金森病症状。
（4）立体定位注射：予Sprague-Dawley大鼠单侧纹状体注射鱼藤酮，发现黑质中酪氨酸羟化酶阳性（多巴胺）神经元显著减少。虽然鱼藤酮立体定位注射是最初方法，但它再次引起了人们的注意，希望这种系统的鱼藤酮处理方法能够消除系统毒性和高死亡率的不良影响。有几项研究对内侧前脑束、腹侧被盖区、纹状体和黑质的鱼藤酮立体定位注射，剂量为0.4～12mg。据报道，这类剂量在黑质和纹状体中造成了约20%和30%～70%的酪氨酸羟化酶阳性神经元的显著剂量依赖性丢失，以及30%～90%的显著的纹状体多巴胺消耗。虽然鱼藤酮立体定位注射不会产生系统性毒性，但据报道它会引起急性毒性，导致液化性坏死和胶质瘢痕。它也不代表环境暴露，因为它绕过了动物的代谢防御。
（5）吸入/鼻内给药：小鼠鼻内鱼藤酮给药使其嗅觉功能衰减和多巴胺能神经元数量减少。长期使用鱼藤酮对多巴胺能黑质纹状体系统造成损伤，或在小鼠和大鼠中产生明显的运动损伤。在鼻内窥镜下，鱼藤酮在嗅球中可以被检测到，在腹侧中脑的水平较低。然而，鱼藤酮在纹状体中是无法检测到的，这表明它通过这条途径到达黑质纹状体的能力是有限的。
（6）静脉注射：静脉灌注鱼藤酮10～18mg/kg连续给药10天，发现给予鱼藤酮处理的大鼠表现出临床的运动障碍和僵直，以及选择性纹状体和苍白球损伤。给大鼠静脉注射鱼藤酮，导致大鼠出现行为障碍，黑质区域α-突触核蛋白的聚集，高度选择性黑质纹状体多巴胺神经元的变性和行为变化包括运动功能减退及僵化。相关研究表明，鱼藤酮导致大鼠运动迟缓，酪氨酸羟化酶免疫活性降低，鱼藤酮剂量依赖性地降低大鼠存活率，每日2mg/kg，共28天，成功造模，且存活率相对其他大剂量的存活率高。静脉给药操作简单，药物可直接进入体循环，药效发挥迅速，但全身毒性较大。
（五）总论
综上，帕金森病的鱼藤酮模型在探讨帕金森病发病原因和发病机制方面具有很大潜力。并且，研究表明鱼藤酮模型能成功的用于测试新型神经保护策略逆转或减缓疾病的进展。值得注意的是，在将来的研究中，研究者应该仔细选择物种、方法以及鱼藤酮处理剂量。
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（谷丽艳）