细胞器及细胞组分的分级分离

细胞内各种颗粒成分的大小、形状和密度不同，采用差速离心或密度梯度离心的方法可以将其分离。蛋白质、核酸等细胞的功能分子存在于亚细胞结构的基质或细胞匀浆离心后形成的上清液中，可以利用层析技术或离心技术进一步分离纯化。电泳技术可以对分离纯化得到的终产物进行初步鉴定。各种细胞器和细胞组分都有其特定的亚显微特征和若干种生化标志物（表3-1），因此可以采用电镜形态观察和生化分析方法来鉴定分离物的成分和纯度。

表3-1　几种细胞器和细胞组分的标志物

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差速离心法是分离细胞和线粒体等亚细胞结构常用的方法。低速离心时，大的组分如细胞核和未破坏的细胞很快沉降，在离心管底部形成小的沉降团块；较高速度离心时，线粒体沉降成块；更高速度加长时间离心时，可以先收集到微粒体，然后收集到核糖体。如果一次离心所得到的组分分离程度不高，可以再次悬浮小沉降块中的组分，反复离心。

差速离心法只能将大小显著不同的组分分开，而速度沉降法可以进行更精细的分离。速度沉降法的方法是首先在离心管中加入稀盐溶液，然后将细胞的抽提液在稀盐溶液上覆一薄层。为了防止对流混合，需要在离心管中制备由顶部到底部逐渐增加的蔗糖溶液的浓度密度梯度（通常为5%～20%）。离心后，混合物中的各组分以不同的速度沉降，形成不同沉降带，各沉降带可以分别进行收集。不同组分的沉降速率取决于它们的大小与形状，通常用沉降系数（S）表示，如蛋白质和核酸的沉降系数在1～200 S之间。在巨大的离心力下，即使较小的生物分子如tRNA和简单的酶分子，都可以根据它们的大小将其分开。

还有一种离心分离方法是平衡沉降法，它取决于细胞成分的浮力密度，与细胞大小形状无关。平衡沉降法的方法是首先在离心管中制备由顶部到底部高浓度差的蔗糖溶液或氯化铯溶液的浓度密度梯度，然后把细胞匀浆均匀分布在该介质中，进行超速离心，匀浆中的不同组分会沉降至与自身等密度处，不再移动，最后分别收集沉降带即可。