蛋白质的分离与鉴定

层析技术是根据蛋白质的形态大小和电荷差异对其进行分类的方法，能纯化并获得非变性的天然状态的蛋白质。柱层析是分离纯化特定蛋白质最常用的方法，操作是将细胞匀浆或经过盐析、有机溶剂沉淀等处理的样品，在常压或高压下通过用固体性颗粒充填所形成的柱，由于不同的蛋白质与颗粒产生的相互作用不同，它们在柱中会被不同程度地滞留，因此可根据其流出柱的时间差异而将其分别收集。

根据所选择的充填颗粒的不同，柱层析可分为四种：①离子交换层析。充填颗粒带有正电或负电，蛋白质按其表面电荷的分布差异被分离。②凝胶过滤层析。充填颗粒为多孔性的凝胶颗粒，可根据蛋白质的大小将其分离。③疏水性层析。该层析将疏水性基团共价结合在充填颗粒上，可根据不同蛋白质表面疏水区域的强弱差异，使其流出柱的时间不同而被分离。④亲和层析。该层析先把能够与蛋白质表面的特定部位进行特异性结合的分子共价连接于惰性多糖类颗粒上，然后根据蛋白质亲和性的不同将其分离。(https://www.daowen.com)

由于氨基酸带有正电荷或负电荷，所以蛋白质往往带有净正电荷或净负电荷。若将含有蛋白质的溶液加上电场，蛋白质分子就会按照它们净电荷的多少、大小及形状的不同，在电场中移动，这一技术称为电泳（electrophoresis）。用电泳可以分析、鉴定蛋白质。根据支持物或原理的不同，电泳可分为滤纸电泳、琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、免疫电泳、等电聚焦电泳和双向电泳等。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可以分析和制备蛋白质及其亚基，优点是速度快、分辨率高，精确性和重复性都非常好。SDS（十二烷基硫酸钠）是一种强变性剂，可以结合并解离细胞和组织中的大多数蛋白质，包括膜蛋白、DNA结合蛋白以及紧密结合的蛋白质复合物等，且大多数蛋白质都可溶解于SDS中。在SDS-PAGE中，SDS与样品中的蛋白质结合，在二硫键还原剂的作用下，经过热变性和二硫键还原，蛋白质的三级结构被破坏，形成蛋白质分子的非折叠衍生物以及蛋白质带上相对一致的负电荷。这样，SDS改变了蛋白质在电泳凝胶上天然的迁移性质。当SDS多肽复合物经过聚丙烯酰胺凝胶时，其运动迁移率完全由其相对分子质量决定。蛋白质经过染色后，可以观察到整齐排列的条带。通过使用已知相对分子质量的蛋白质标记物，可以估计多肽链的相对分子质量。