2.2.1　多能干细胞来源

多能干细胞（pluripotent stem cells，PSCs）具有能够自我更新、产生机体所有细胞类型的能力，包括胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。胚胎干细胞一般来源于植入前胚胎的内细胞团，而诱导多能干细胞一般来源于体细胞重编程（reprogramming）［18］。PSCs易于在体外培养扩增，并且便于进行遗传操作，已经成为研究生长发育、疾病发生等方面的重要模型［19］。由于PSCs能够产生机体所有的细胞类型，因此其可以通过在体外定向分化，产生不同组织器官的细胞并最终形成类器官［20，21］。

多能干细胞来源的类器官的构建，本质上是一个模拟器官发育的过程，其中三胚层的出现为各器官的形成提供了基础。消化道来源于定型内胚层（definitive endoderm），因此构建由多能干细胞来源的消化道类器官，首先需要诱导分化出定型内胚层。作为转化生长因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）超家族的一员，Activin A能够在体外促进干细胞向定型内胚层分化［22］，目前已经被广泛应用于多能干细胞来源的消化道类器官的构建过程［22-27］。通过在培养基中加入Activin A刺激，贴壁生长的干细胞会逐渐形成光滑的片状内胚层结构，并伴随转录因子FOXA2和SOX17等内胚层标志物的表达。

在胚胎发育过程中，内胚层经过特化形成前肠和（中）后肠，即原始肠管（gut tube），随后进一步特化形成不同器官原基，其中前肠发育成为食管、胃等消化系统器官及其他系统器官，后肠发育为消化系统中的肠道［28］。因此，为构建消化道类器官，在多能干细胞分化为定型内胚层后，需要进一步诱导其向前肠或后肠的特化。研究表明，成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）信号和Wnt信号能够促进内胚层向后肠的特化，并且如果在该过程中抑制骨形成蛋白（bone morphogenic protein，BMP）信号和激活视黄酸（retinoic acid，RA）信号，那么内胚层会向前肠进行特化［28-30］。据此，多能干细胞经Activin A诱导形成定型内胚层后，FGF4和Wnt3A的处理会使其向后肠部分进行特化［26，31］，在此基础上加入Noggin（BMP信号抑制因子）和RA处理会使其向前肠部分进行特化［23，24，27，31］。值得注意的是，Wnt信号和RA信号激活时间的差异会导致前肠进一步向不同区域分化，其中短时间的激活会使其向前肠前端（即食管）分化，而长时间的激活则会趋向于前肠后端（即胃）的分化［27］。因此，这些处理均是在体外模拟体内前后肠的发育过程。体外诱导前后肠特化的过程中，在片状的内胚层表面会自发形成三维的细胞团结构，又称为类球体（spheroids）［32］，这些类球体可以从内胚层表面自然脱离进入培养基中，代表了分化成熟的前肠或后肠细胞，并表达特异性细胞标志物SOX2（前肠）或CDX2（后肠）等。类球体的出现是前后肠成功特化的重要标志，也是二维生长的干细胞向三维类器官转变的重要阶段。

前肠或后肠的类球体脱离进入培养基后，将其收集并包裹至富含层粘连蛋白的基质胶（matrigel）中进行三维培养，最终可发育成为类器官［32］。而不同的生长因子组合，可以诱导类球体分化成为不同种类的类器官。研究表明，表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和FGF10可以在三维培养中诱导前肠前端类球体发育成为食管类器官，在该过程中，类器官单层上皮逐渐发育成熟为复层鳞状上皮结构，很好地再现了体内食管上皮的发育过程，并且各种细胞类型标志物的表达水平与体内一致，体内移植实验也证明食管类器官具备一定的生理功能［27，33，34］。相似地，前肠后端类球体在EGF、Noggin和RA的处理下，能够在三维培养中特化成为胃类器官，并且可以分别发育为不同胃区的类器官，包括胃体类器官［23］和胃窦类器官［24］，其中，胃体类器官的发育需要Wnt等信号的激活［23］，不同胃区类器官的建立表明类器官系统是探究器官区域化的有力工具（图2-3）。(https://www.daowen.com)

图2-3　干细胞来源的胃体和胃窦类器官的构建过程［23］

前肠部分能够发育成为多种器官，而后肠最终发育成为消化道中的肠道。三维培养的后肠类球体能够发育为成熟的肠道类器官，该过程需要的生长因子与成体小肠类器官体外培养所需要的生长因子一致，即EGF、Noggin和R-spondin1（Wnt信号激活因子）［35］。与体内组织结构相一致，分化成熟的肠道类器官具有绒毛和隐窝样结构，并且具有功能性吸收型细胞及其他分化细胞，包括杯状细胞、潘氏细胞和内分泌细胞等。将这些类器官移植至小鼠体内会产生人小肠上皮结构，并且具有生理功能［26］。此外，在多能干细胞来源的类器官中，还存在间充质细胞（mesenchymal cells），其包裹在上皮结构周围，这些细胞可能是来源于内胚层诱导后残留的中胚层细胞［36］。