2.2.2 成体干细胞来源
目前，已在成年生物个体的许多组织器官中鉴定出成体干细胞。与胚胎干细胞不同，成体干细胞是具有限分化潜能的多能或单能干/祖细胞，只能产生特定的细胞类型。成体干细胞所在的特定微环境称为干细胞生态位或壁龛（stem cell niche），该环境能提供调节细胞命运和更新的外在信号，这也解释了为什么不同组织器官来源的成体干细胞的培养条件都有所不同。同时，成体干细胞来源的类器官的主要优势是能够长期保持细胞的基因组稳定性和组织学特征。需要指出，成体干细胞来源的类器官只有上皮细胞，缺乏间质、血管等微环境因素［37］。
成体干细胞来源的类器官的构建，本质上是模拟生理细胞更新迭代和损伤修复的过程。目前主要采用的培养方式是以基质胶包裹为主的培养系统：将从各个组织器官中获取的、具有再生能力的成体干细胞包裹进基质胶中，从而模拟成体天然的细胞外环境骨架。此外，气液界面（air-liquid interface）的培养系统也被越来越多的研究者用于共培养等领域的探索中［38］。成体干细胞来源的类器官在该环境下一般能建立或保持完整的干细胞生态位，因此只需要在培养基中添加其他微环境的细胞因子即可。类器官中的干细胞通常表现出强大的自我更新能力，因此大多数培养的类器官主要以未成熟分化的干细胞和祖细胞组成，但可根据实际需要调整培养基中生长因子或小分子等成分的种类或浓度，进而诱导其定向分化成熟。
在各段消化管中，黏膜的结构差异较大，是各自功能的决定性区域，也是上皮成体干细胞的主要聚集区域。因此，对各段消化道的干细胞位置与功能的认知，对于成体干细胞来源的类器官的构建与鉴定有着重要的作用。
1.食管
尽管目前对于食管上皮的干细胞群依旧存在争议，但普遍认为食管上皮是通过基底细胞群的增殖分化来维持黏膜上皮的稳态。在最近的小鼠模型中也证实了表达角蛋白KRT5、转录因子SOX2和P63的基底细胞能持续更新以维持上皮稳态［39］。Aaron D.DeWard等首次从小鼠食管黏膜中建立了具有复层鳞状上皮的食管类器官，并发现表达SOX2的基底细胞中包含干细胞和转运扩增细胞［40］。而后续Youngtae Jeong等发现高表达CD49F和低表达CD24的未分化的食管基底细胞呈现出更高的克隆形成能力，其中，P63在调节基底细胞的自我更新基因表达中起重要作用［41］。同时，Véronique Giroux等鉴定出一个长寿的干/祖细胞群，并发现表达KRT15的基底细胞在类器官中显示出自我更新、增殖和分化的能力。因此，在分离食管黏膜层后，可通过分选干细胞群或直接将其置于基质胶中进行培养，从而自发形成食管类器官。与其他类器官的培养类似，食管类器官的培养也离不开Wnt信号、EGF信号和Notch信号的支持。Véronique Giroux等在此基础上进行了优化，从而实现从小鼠正常食管上皮中提取细胞进行类器官培养，而人类食管类器官的培养则是在小鼠培养系统的基础上进行优化并建立的［42］。
2.胃
长期以来，位于胃腺体峡部区域具增殖能力的细胞一直被认为是胃上皮的干细胞。但后续又有研究者在胃窦腺的底部发现肠干细胞标志物Lgr5，并且通过谱系追踪的方式证明了这群细胞的干细胞特征，具有能分化为胃窦腺上皮所有类型细胞的能力［9，43］。同时，通过谱系追踪的方式也发现了位于胃底/体腺底部的表达Troy的细胞具自我更新并生成对应腺体所有类型细胞的能力［44］。需要指出，前期研究表明Troy＋细胞为完全分化的主细胞，但后续研究发现其能被特定的条件激活，从静止状态恢复到能够增殖的状态，因此也被称为储备干细胞［45］。近期，Joseph Burclaff等也分别证实了峡部的干细胞具有多能性，且通过自我更新的方式维持附近区域细胞的更新迭代；而Troy＋干细胞群则主要维持腺体底部主细胞的再生［46］。(https://www.daowen.com)
尽管目前对胃干细胞的存在特征依旧存在争议，但对于成体干细胞来源的类器官构建而言，获取胃上皮完整的腺体结构是成功构建的先决条件。上文提及胃不同部位具有不同的腺体结构，因此根据腺体的来源将胃腺体类器官分为两种：胃底/胃体腺类器官和胃窦腺类器官。从不同区域获得相应的腺体后，直接将腺体或分选出的干细胞与基质胶混合进行培养，最终能够形成对应腺体的类器官。首例成功构建的成体干细胞来源的胃类器官源自小鼠胃窦腺表达Lgr5的细胞［9］，通过在肠道类器官培养基的基础上添加FGF10和胃泌素（gastrin）来实现长期稳定培养，这样的培养体系后续也被证实可以用于Troy＋干细胞来源的小鼠胃类器官的培养。在该培养条件下形成的类器官以空泡形态为主，可以观察到主细胞（LIPF＋和PGA5＋）和颈黏液细胞（MUC5AC＋和MUC6＋），适当降低Wnt的浓度即可诱导表面黏液细胞（MUC5AC＋）和内分泌细胞（GAST＋、GHRL＋、SST＋和HDC＋）的产生。当完全撤去Wnt、Noggin和FGF10后，可以观察到分化的胃小凹细胞（GKN1＋和GKN2＋）的形成［47］。然而，目前还没有比较完善的体系能够长期稳定维系壁细胞（parietal cell）质子泵（ATP4A和ATP4B）的表达与功能。而对于人胃类器官的培养，只需要在小鼠的培养体系中加入小分子A8301（TGF-β信号抑制剂）即可维持其长期稳定的生长。
3.小肠
在正常生理情况下，肠上皮进行快速自我更新，该过程通过隐窝底部肠干细胞的增殖和分化来完成。隐窝底部的Lgr5＋干细胞通过不对称分裂产生瞬态放大（transiently amplified）细胞［46，48］，随后瞬态放大细胞演变为分化倾向的祖细胞，并向上迁移至绒毛区域，逐渐分化成为吸收型上皮细胞和分泌型上皮细胞（包括肠内分泌细胞、杯状细胞和簇细胞）；而向下迁移的瞬态放大细胞则分化为潘氏细胞。通过分离小肠上皮的隐窝结构并置于基质胶中进行培养，其能自发性地形成类器官结构。
首例成体干细胞来源的小肠类器官是从小鼠Lgr5＋干细胞构建的［49］。Wnt、Notch、EGF、Hippo和BMP信号通路已被证明对肠上皮的稳态维持十分重要，因此在培养基中补充EGF、Noggin和R-spondin1即可实现长期稳定的培养。而人类小肠类器官的培养则相对复杂，需要额外加入Wnt3a、烟酰胺（nicotinamide）、A8301、胃泌素和SB202190（p38抑制剂）才能保证类器官的长期稳定生长。然而在该培养条件下，类器官处于高增殖状态，当撤去Wnt3a、烟酰胺和SB202190后，方可观察到杯状细胞、肠内分泌细胞和潘氏细胞的分化。
4.大肠
结直肠类器官是第一个成功构建的类器官模型，并且展示表达EPHB2的细胞在体外能扩增为未分化和具有多潜能的细胞群［50］。Toshiro Sato等在参照小肠类器官的方式进行结直肠类器官的构建时发现，其需要更高的Wnt信号才能维持正常存活。但需要明确，在该条件下形成的结直肠类器官呈现高增殖的状态，并且失去正确的分化细胞类型，只有撤去Wnt后才逐渐形成正常的分化谱系［50］。但仅撤去Wnt时并不能促进人结直肠类器官的成熟分化，还需要将培养基中的烟酰胺和SB202190一并撤去后才能观察到成熟的杯状细胞（MUC2＋）和肠内分泌细胞（CHGA＋）的形成，类器官整体表现为出芽结构。