6.2.3　肾脏类器官的鉴定

在肾脏类器官构建的过程中，往往会根据实际需求对诱导方案进行相应的调整探究，因此对处于特定诱导阶段的肾脏类器官的结构成分或功能进行鉴定是必不可少的。正如前文肾脏类器官的构建中所描述的，研究者们多是通过多种组织细胞染色的方法对肾脏类器官的组织结构和细胞类型进行鉴定区分。例如，在诱导前期，可以通过对标志物MIXL1和T进行染色以鉴别后端原条的形成；对标志物OSR1、PAX2和LHX1进行染色以鉴定间质中胚层的形成。后肾间质的形成是许多肾脏类器官诱导过程中的重要一环，可以对标志物SIX2、WT1、PAX2、HOXD11等进行染色以对其进行鉴别。其他分化程度较高的细胞类型，也可以通过不同的细胞标志物进行区分［46］，如足细胞（WT1＋PODXL＋NPHS1＋）、近端小管（LTL＋CDH2＋）、髓袢（CDH1＋UMOD＋）、远曲小管（CDH1＋UMOD-）以及集合管（CDH1＋GATA3＋）等。

除此之外，还可以通过测序手段对肾脏类器官的组织成分做进一步鉴定。前文所提到的Frans Schutgens研究团队就是通过转录组测序技术对他们所构建形成的肾脏类器官成分做了进一步鉴定。并且随着测序技术和手段的进步，单细胞测序技术作为一种分辨率更高、信息输出量更大的测序手段，可以提供更开阔的视野以及更好的视角以协助鉴定。因此，他们还通过单细胞转录组测序技术以及免疫荧光染色对相关结果进行了进一步确认和分析，不仅确认了所有的肾小管上皮类器官都是PAX8阳性的，也具备上皮性质，还确认了集合管细胞（CDH1＋GATA3＋）的存在，以及主细胞（AQP3＋）和闰细胞（SLC4A1＋）的存在。同时，他们还发现，髓袢特异性标志物（UMOD、SLC12A1）和远端小管标志物（CALB1）表达有限，仅在少数细胞中存在表达。又如Haojia Wu等人［44］利用单细胞测序技术对两种经典的诱导方案（Ryuji Morizane方案和Minoru Takasato方案）所诱导出的类器官进行了分析，发现两种方案都会产生10%～20%的非肾脏细胞。(https://www.daowen.com)

除了通过对细胞标志物进行染色以及单细胞测序技术对诱导产生的肾脏类器官的细胞类型进行鉴别以外，还可以通过CRISPR-Cas9基因编辑技术在人诱导多能干细胞中构建荧光报告系统以鉴别标记不同的细胞类型。Jessica Vanslambrouck等［47］就于2019年通过构建不同报告基因敲入的人诱导多能干细胞对诱导形成的肾脏类器官进行标记，包括肾单位祖细胞（SIX2＋CITED1＋）、足细胞（MAFB＋）、近端小管细胞（LRP2＋HNF4α＋）以及集合管细胞（GATA3＋）等。通过构建报告基因小鼠也可以对特定细胞进行标记示踪，如Yasuhiro Yoshimura等［48］于2019年就采用了MAFB-GFP报告基因小鼠对足细胞进行标记示踪，通过特定的诱导分化方案使小鼠肾单位祖细胞尽可能地分化形成足细胞。在此基础上，他们采用NPHS1-GFP报告基因对足细胞进行示踪，对NPHS1-GFP报告基因敲入的人诱导多能干细胞进行诱导分化，形成了足细胞占比大于90%的人肾脏类器官。

由于肾脏行使着复杂且重要的生理功能，故对于肾脏类器官进行一定的功能鉴定显得尤为必要。Frans Schutgens等人就对肾小管上皮类器官的功能进行了评估鉴定［45］。首先是将肾小管上皮类器官在含或不含近端小管外源性物质外排泵ABCB1（Pglycoprotein，P-gp）特异性抑制剂PSC-833（5μM）的培养基中进行培养。第二天均加入1μM钙黄绿素AM（calcein-AM）37℃孵育1小时。钙黄绿素AM本身并不带光，但它能够轻易穿透活细胞膜，并且可以在细胞内被酯酶剪切形成可以发出绿色荧光的钙黄绿素。所以在孵育1小时后，可以对细胞进行固定以用于共聚焦成像分析或进行裂解以对荧光信号强度进行读取分析。当P-gp在肾小管上皮类器官中能够发挥功能时，其活性应该会被PSC-833抑制，从而使带荧光的钙黄绿素在细胞内积累。在含PSC-833的组别中也成功观察到了绿色荧光的大量积累，且与不含PSC-833的组别存在显著性差异。结果表明，该方法培养形成的肾小管上皮类器官中存在大量功能性近端小管。