6.2.4 肾脏类器官的应用与展望
随着人多能干细胞来源的肾脏类器官诱导方案的不断改善和发展，人们已经能够构建出包含多种细胞类型或较单一细胞类型的肾脏类器官。这使得肾脏类器官成为一种十分便利的研究模型，广泛用于模拟肾脏疾病、药物筛选、毒性验证、模拟肾脏发育和再生等。
1.遗传性肾脏疾病模拟
慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是一个全球范围内的重大公共健康问题。根据《柳叶刀》杂志于2017年报道的数据［27］，全球有近7亿人患有CKD，约占全世界总人口的9%。造成慢性肾脏病的原因多种多样，包括低出生体重、怀孕、糖尿病、高血压、肥胖和衰老等。除此之外，多囊肾病等许多遗传相关的肾脏疾病也是造成慢性肾脏病的风险因素。目前人类已知的遗传性肾脏疾病超过160种［46］，多囊肾病是其中最为常见的疾病之一。
而最早使用肾脏类器官去模拟肾脏疾病的例子之一，就是Benjamin Freedman等［49］于2015年使用人多能干细胞来源的肾脏类器官对多囊肾病（polycystic kidney disease，PKD）进行模拟。先是采用CRISPR-Cas9基因编辑技术对人多能干细胞中的PKD1和PKD2基因进行敲除处理，之后诱导形成肾小管类器官。类器官在培养约35天后能够明显观察到囊肿（cyst），58天时能够在肾小管类器官中观察到大的、半透明的囊肿结构。但是，囊肿的形成效率较低，大约仅有6%的类器官中能形成囊肿。
后来，Benjamin Freedman和他的学生Nelly Cruz等［50］于2017年对该多囊肾病模拟方案进行了改进。在对类器官进行诱导分化21天时，将类器官由贴壁培养转为悬浮培养，囊肿的形成效率提升至约75%，并且囊肿直径可达1 cm，肉眼可见。同时，结果也表明细胞外基质微环境对于多囊肾病中囊肿的发生有重要影响。
Jian Hui Low等［51］于2019年构建了常染色体隐性遗传性多囊肾病（autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD）患者成纤维细胞来源的人诱导多能干细胞，然后用CRISPR-Cas9基因编辑技术对该患者来源的人诱导多能干细胞中PK HD1基因座上的突变碱基进行修正，形成了碱基修正后的患者来源的人诱导多能干细胞，最后将未修正与修正的人诱导多能干细胞诱导形成肾脏类器官。结果显示毛喉素（forskolin）或环磷酸腺苷（c AMP）能够明显促进人常染色体隐性遗传性多囊肾病类器官中囊肿的形成，但碱基修正后的人常染色体隐性遗传性多囊肾病类器官则展现出了和野生型人多能干细胞来源的类器官相似的表型，即仅在类器官边缘位置出现了较小的囊肿。他们还开展了体外葡聚糖摄取实验，以评估囊肿对肾脏类器官功能的影响。结果显示，与野生型人多能干细胞来源的类器官相似，无囊肿的该病患者来源的类器官会对不同大小的葡聚糖进行选择性吸收。但是无论葡聚糖大小，有囊肿形成的该病患者来源的类器官几乎丧失了对葡聚糖的吸收能力。相关结果都表明他们成功构建了人源常染色体隐性遗传性多囊肾病类器官，为该病的相关基础研究和个性化治疗与药物筛选提供了良好的平台，并为其他遗传性肾脏疾病研究开拓了思路。2021年，Sara Howden等［52］则通过构建PK HD1基因缺失的人诱导多能干细胞来源的输尿管上皮类器官对常染色体隐性遗传性多囊肾病中输尿管上皮起源的囊肿进行了模拟。
对于常染色体显性遗传性多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）类器官模型而言，Tatsuya Shimizu等［53］于2020年构建了人源常染色体显性遗传性多囊肾病类器官，并且建立了相应的药物筛选平台。Yasaman Shamshirgaran等［54］于2021年使用多四环素诱导型Cas9人诱导多能干细胞实现了PKD1和PKD2敲除型肾脏类器官的快速构建，且敲除效率可超过80%，成功对常染色体显性遗传性多囊肾病进行了体外模拟。
肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是另一种较为常见的肾脏疾病，也是导致慢性肾脏病的原因之一。肾病综合征可由NPHS1（编码蛋白为Nephrin1蛋白）或NPHS2（编码蛋白为Podocin蛋白）基因突变引起，其最主要的临床表现之一就是蛋白尿。肾小球毛细血管壁由内向外可分为三层结构，分别为内皮细胞层、基底膜层和上皮细胞层，这三层结构共同组成了肾小球滤过系统。其中，上皮细胞高度特化，细胞边缘存在不规则的伪足样突起，故也称为足细胞。相邻的足细胞通过裂孔隔膜（slit diaphragm，SD）连接，裂孔隔膜则是防止蛋白质被滤过的最后一道屏障。而Nephrin1蛋白和Podocin蛋白皆是跨膜蛋白，是裂孔隔膜的重要组成成分，那么NPHS1或NPHS2基因发生突变后则可能会使裂孔隔膜受损进而导致蛋白尿的形成，从而引发肾病综合征。
Shunsuke Tanigawa等［55］于2018年报道了一项关于人源肾病综合征肾脏类器官的诱导与构建的研究，相应的患者存在着NPHS1基因突变。研究表明，肾病综合征患者来源的肾脏类器官可以再现肾病综合征的一些症状，如定位在细胞表面的Nephrin1蛋白减少和裂孔隔膜形成受损。此外，通过TALEN基因编辑技术对患者来源的诱导多能干细胞中NPHS1基因突变位点进行修正，修正后的诱导多能干细胞来源的类器官则能够很好地形成裂孔隔膜。2021年，Tomoko Ohmori等［56］又报道了两例人源肾病综合征肾脏类器官，这两例类器官来自不同NPHS1基因突变位点的肾病综合征患者，结果同样显示出细胞表面的Nephrin1蛋白减少。同时，Lorna Hale等［57］也有过类似的报道，诱导构建了人源NPHS1基因突变的肾小球类器官，并发现Nephrin1蛋白和Podocin蛋白表达水平降低。
2022年，Jitske Jansen等［58］构建了杂合NPHS2基因突变的肾病综合征患者来源的类器官。研究显示该人源肾病综合征肾脏类器官中的Podocin蛋白表达水平很低且Nephrin1蛋白定位存在异常，同样，这种表型可以通过对该人源诱导多能干细胞中NPHS2突变位点的修正得到回补。而且，测序结果表明，修正后的诱导多能干细胞来源的类器官中血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）相关通路活性和转录因子活性增加，这表明肾病综合征可能还会对肾小球足细胞以及血管网络产生一定影响。
除多囊肾病以及肾病综合征以外，先天性肾脏和尿路畸形（congenital anomalies of the kidney and urinary tract，CAKUT）也可能会造成慢性肾脏病。在高收入国家当中，先天性肾脏和尿路畸形即是儿童患慢性肾脏病的主要原因［59］。Jaap Mulder等［60］就于2020年报道了一项研究，成功从婴儿和儿童的小体积尿液或袋装尿液中收集到了可重编程细胞并构建了诱导多能干细胞，然后诱导形成了人源的先天性肾脏和尿路畸形肾脏类器官。这项研究表明小体积尿液也可以是先天性肾脏和尿路畸形患者特异性人诱导多能干细胞和肾脏类器官的可靠来源，并为人源肾脏类器官模型的构建提供了新的参考。多囊性肾发育不良（multicystic dysplastic kidney，MCDK）是先天性肾脏和尿路畸形的一种。Shin-Ichi Mae等［61］于2020年通过CRISPR-Cas9基因编辑技术对人诱导多能干细胞中的H NF1β基因进行杂合敲除，经过特定方式地诱导分化后构建了具有多囊性肾发育不良的一些表型的输尿管芽肾脏类器官。
另有一些研究对其他可能会导致慢性肾脏病患病风险增加的遗传相关的疾病进行了模拟。如Thomas Forbes等［62］于2018年构建了人源IFT140基因突变型肾脏类器官，以对肾单位肾痨及相关纤毛病（nephronophthisis related ciliopathy，NPHP-RC）进行模拟。因载脂蛋白L1（APOL1）基因的两种突变类型（G1和G2）会提高撒哈拉以南非洲血统人群患慢性肾脏病的风险，Esther Liu等［63］于2020年通过CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了载脂蛋白L1的G1型人肾脏类器官，并在单细胞转录组水平上建立了相应的细胞图谱。又如Jin Won Kim等［64］于2021年构建了GLA基因敲除的人诱导多能干细胞来源的肾脏类器官，以对法布里病（Fabry disease）进行模拟。
这些研究都表明人诱导多能干细胞来源的肾脏类器官能够很好地对遗传相关的肾脏疾病进行模拟，展示出相关疾病表型。同时，在多囊肾病、肾病综合征等类器官模型的构建过程中都能看到基因编辑技术的身影，这也表明基因编辑技术的快速发展对肾脏疾病类器官模型的构建起到了重要推动作用。
2.病毒感染模拟
类器官还可以被用于研究病毒感染对肾脏的影响。例如，Louisa Helms等［65］于2021利用人多能干细胞来源的肾脏类器官在SARS-Co V-2对肾脏的影响方面进行了一定的探讨，结果显示SARS-Co V-2相对来说更倾向于感染肾脏类器官中的近端小管细胞等。Jitske Jansen等［66］于2022年通过对SARS-Co V-2感染的人诱导多能干细胞来源的肾脏类器官进行单细胞测序，确认了病毒会感染近端小管上皮细胞和足细胞，同时也发现促纤维化信号通路表达上调。这也在某种程度上解释了COVID-19与急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）、慢性肾脏病之间存在的相关性。
3.肾脏肿瘤模拟(https://www.daowen.com)
肾癌是一种常见的泌尿系统癌症，其发病率和死亡率在全球所有癌症中排第16位，在世界范围内的发病率约占成年人恶性肿瘤的2%～3%，而在儿童癌症中，肾癌约占7%。据国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）估计，2020年全球报告了新增肾癌病例约43万，肾癌死亡病例约18万。据中国国家癌症中心于2022年公布的最新一期癌症数据，2016年中国肾癌新增病例7.58万，发病率为3.51/10万，死亡病例2.69万，死亡率为1.17/10万。
肾脏肿瘤存在多种亚型，包括肾细胞癌（renal cell cancer，RCC）、肾母细胞瘤（Wilms tumor）、肾透明细胞肉瘤（clear cell sarcoma of the kidney，CCSK）和肾恶性横纹肌样瘤（malignant rhabdoid tumours of the kidney，MRTK）等。尽管有许多肾癌患者已经受益于多种化疗药物，如5-氟尿嘧啶（5-FU）、吉西他滨（gemcitabine）等，但肾癌整体上对化疗药物的敏感性较低，化疗的临床结果整体上并不理想。而且由于肿瘤异质性等多种因素，一些肾癌靶向药物的治疗效果在个体间存在一定差异。因此，精准医疗和个性化治疗在肾癌的临床诊治方面存在巨大潜力，一方面可以区分出对化疗药物较为敏感的患者，另一方面可以根据个体情况选择不同的靶向药物等。类器官的快速发展则为个性化治疗的开展提供了良好的模型。
Camilla Calandrini等［67］于2019年建立了第一个儿童肾癌类器官生物库，该肾癌类器官生物库含多种肾癌亚型，包括肾细胞癌、肾母细胞瘤、肾恶性横纹肌样瘤等。研究者们发现儿童肾癌类器官在很大程度上能够保留原有肿瘤组织的特征。研究者们能够高效地从大多数儿童肾脏肿瘤中获取对应的类器官并进行快速扩繁，这为相应患者的药物筛选和个性化治疗提供了便捷的平台，也为肾癌基础研究提供了有效的临床前模型。
Frans Schutgens等［45］、Jenny Wegert等［68］于2019年分别构建了有效的患者来源的肾母细胞瘤类器官，为肾母细胞瘤的诊疗提供了新的临床前模型，可以为更好地评估肾母细胞瘤治疗方案创造条件。Zhichao Li等［69］于2022年报道了一种肾脏肿瘤类器官的培养系统，研究者们通过该系统成功获得了33个患者来源的肾细胞癌类器官系。结果显示肾细胞癌类器官保留了其对应肿瘤的组织结构、生物标志物表达谱、转录组特征和遗传学改变。研究者们对肾细胞癌类器官进行了化疗药物筛选，与预期一致，大多数肾细胞癌类器官对常规化疗药物不敏感。同时，研究者们也分析了靶向药物对肾细胞癌类器官的作用，结果发现m TOR信号通路抑制剂对几种肾细胞癌类器官的生长显示出较好的抑制作用，该结果与几个临床试验结果一致。这些结果都显示肾细胞癌类器官能够很好地保留其原始肿瘤组织的特征，并且可以作为有价值的临床前模型以供个性化治疗和相关研究的开展。
4.药物筛选、验证与毒性试验
将肾脏类器官用于药物筛选和药物效果验证可以在一定程度上减少实验动物的使用并且可以较为便利地开展实验。同时，运用肾脏类器官可以更好地筛选出对特定肾脏疾病有效的药物。例如，错误折叠的蛋白质在细胞内大量积累会导致毒性蛋白质病。MUC1黏蛋白肾病（mucin 1 kidney disease，MKD）是由MUC1基因移码突变（MUC1-fs）引起的一种罕见病。Moran Dvela-Levitt等［70］于2019年通过患者来源的类器官等多个模型表明MUC1黏蛋白肾病是一种毒性蛋白质病。他们通过药物筛选找到了BRD4780这一化合物，并在人源类器官等多个模型中证明了BRD4780能够通过结合TMED9来清除MUC1-fs蛋白。这一发现为MUC1黏蛋白肾病以及其他毒性蛋白质病的治疗奠定了一定的基础。
又如，Benjamin Freedman和他的学生Stefan Czerniecki等［71］于2018年在报道一种高通量肾脏类器官筛选平台时，意外地发现非肌肉肌球蛋白Ⅱ（NMII）抑制剂blebbistatin在12.5μM时能够明显促进多囊肾病类器官形成囊肿，这也表明肌肉蛋白相关通路可能与多囊肾病发生有关。而对于COVID-19，Vanessa Monteil等人［72］早在2020年5月就利用人多能干细胞来源的肾脏类器官验证了人源重组可溶性ACE2蛋白（human recombinant soluble ACE2，hrs ACE2）对于SARS-Co V-2感染的抑制作用。他们通过单细胞测序手段报道了血管紧张素转化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）会在人多能干细胞来源的肾脏类器官的近端小管和部分足细胞中表达。SARSCo V-2会直接感染人多能干细胞来源的肾脏类器官，而添加hrs ACE2则能够抑制SARS-Co V-2对肾脏类器官的感染。Jan Wysocki等［73］也于2021年利用人多能干细胞来源的肾脏类器官验证了一种新型的hrs ACE2短变体抗SARS-Co V-2感染的效果。
在可以被用于验证药物有效性的同时，肾脏类器官也已经被证明可以用于进行肾毒性试验（nephrotoxicity assay）。例如，Jenny Digby等［74］于2019年就利用人诱导多能干细胞来源的肾脏类器官对顺铂（cisplatin）引起的急性肾损伤进行研究评估。急性肾损伤的临床表现为肾功能的急速下降，而临床药物对于肾脏的毒副作用则是急性肾损伤的一大诱因。顺铂是一种治疗实体瘤的化疗药物，但用药剂量会受到其对肾脏的毒性的限制，而急性肾损伤则是顺铂治疗实体肿瘤的一种并发症。研究者们通过一种可以简单、高效生产类器官的方法，对顺铂损伤肾脏类器官的效应进行了评估。这项研究证实了人肾脏类器官可以用来模拟由顺铂引起的肾脏损伤，有助于发现新的急性肾损伤生物标志物以及开发更好地治疗方案。Jin Won Kim等［75］于2021年用人诱导多能干细胞来源的肾脏类器官对免疫抑制剂他克莫司（tacrolimus）所产生的肾脏毒性进行了研究。结果表明，人诱导多能干细胞来源的肾脏类器官是探究他克莫司产生肾脏毒性的有效体外模型，并且自噬在他克莫司所引起的肾脏毒性中起着重要作用。Ramila Gulieva等［76］则于2021年使用人诱导多能干细胞来源的肾脏类器官对不同冻存保护剂的毒性进行了对比，探讨了肾脏类器官在冷冻保存研究中的潜力。还有研究者于2022年先用人诱导多能干细胞来源的肾脏类器官鉴定出HMOX1可以作为毒性应激的标志基因［77］。然后在人诱导多能干细胞中构建了HMOX1报告基因，使诱导形成的肾脏类器官能够对不同药物以及药物剂量引起的肾脏毒性产生相应的反应，反应的直观表现为荧光强度的强弱。
5.其他方面应用
肾脏也发挥着一定的内分泌功能，可以合成促红细胞生成素、肾素、前列腺素以及活化维生素D等。肾素对于盐的重吸收、血压调节等起着重要作用。Anusha Shankar等［78］于2021年通过多种成像技术以及单细胞转录组测序分析，成功对人诱导多能干细胞来源的肾脏类器官中产生肾素的基质细胞进行了定位与表征，并且发现在类器官被植入小鼠皮下后能够维持肾素的分泌。同年，他们又报道了人诱导多能干细胞来源肾脏类器官同样能够活化维生素D［79］。
肾脏中的肾小管细胞在发生损伤后具有一定的自我修复能力。Navin Gupta等［80］于2022年用人诱导多能干细胞来源的肾脏类器官对肾脏损伤和修复进行了模拟，验证了肾脏类器官中近端小管内在的损伤修复能力。而经过多次顺铂处理后，肾脏类器官近端小管对于损伤的响应则转变为不完全修复。在此基础上，通过对单细胞核转录组测序结果和公共数据库中的相关单细胞转录组数据进行分析，发现包括FANCD2、RAD51在内的同源介导的双链DNA修复（homology-directed repair，HDR）基因在肾小管内在修复过程中表达上调，但在不完全修复过程中表达下调，而DNA连接酶Ⅳ抑制剂SCR7能够改善类器官损伤萎缩情况，并且可以挽救FANCD2的表达。由此可见，肾脏类器官也可以作为一种模型帮助我们开展一些有关肾脏功能的研究。
而进一步地将基因编辑技术与肾脏类器官构建方案相结合之后，我们或许能够看到更为广阔的应用前景。例如Rosemarie Ungricht等［81］则于2022年使用多四环素诱导型Cas9人诱导多能干细胞建立了肾脏类器官的全基因组CRISPR筛选平台。基于这个平台，他们开展了功能缺失筛查，对肾脏发育过程中的功能性基因以及肾脏各细胞谱系中与细胞增殖相关的基因进行了一定探究。还在肾脏类器官诱导分化的不同时间点用多四环素诱导基因敲除，从而在肾脏类器官发育分化的不同阶段对相关基因的功能进行探究。同时，他们也对肾脏疾病相关基因进行了筛选鉴定。因此，Rosemarie Ungricht等所构建的类器官平台在肾脏发育研究方面展现出了巨大的潜力。
6.展望
肾脏类器官的构建方案相对来说已经发展得较为成熟，人们能够构建出人多能干细胞来源的含偏单个或多个肾脏谱系细胞的肾脏类器官，并且也能够从患者来源的多能干细胞出发，诱导出患者特异性的肾脏类器官，这为个性化诊疗提供了一个快速且便利的模型平台。尤其对于患有遗传性肾脏疾病的患者来说，这无疑是一个福音。同时在有关肾脏损伤模拟方面，肾脏类器官也展现出了较好的表型，这为可能的药物筛选和验证提供了可行的模型。
但同时，现阶段的肾脏类器官仍存在着许多亟待解决的问题。由于肾脏是一个具有复杂结构和功能的实质性器官，那么首当其冲的便是，如其滤过和重吸收功能等，如何在肾脏类器官中进行简单的模拟仍是一个十分艰难的问题。其次，大多数诱导方案所诱导出的肾脏类器官仍存在着血管化程度较低、组织不够成熟等多方面问题。这些都限制了肾脏类器官在再生医学等多方面领域的应用。庞大的慢性肾脏患者群同样代表着庞大的需求，这更为肾脏类器官的相关基础研究增添了一份使命色彩，相信随着多能干细胞定向诱导、3D培养以及基因编辑等技术的进步，这些困难在不久的将来能够被克服。