6.2.2 肾脏类器官的构建
1.肾脏发育概述
肾脏是一个较复杂的器官，含有10种以上不同类型的细胞。这些细胞功能各异，细胞特征不尽相同。而类器官作为新型的研究模型已经被广泛运用于多个领域，许多组织或器官的构建方式也已较为完善。对于肾脏类器官来说，其多是通过对多能干细胞进行定向诱导分化来构建的。因此，在描述定向诱导分化方案之前，了解肾脏的发育过程对于理解诱导方案至关重要。
哺乳动物肾脏发育起始于间质中胚层（intermediate mesoderm，IM），而间质中胚层则源于原条（primitive streak，PS）。原条为胚胎由二胚层胚盘向三胚层胚盘发育的过程中形成的结构，原条细胞源自上胚层。原条细胞不断增殖，经过迁移扩展，形成了三胚层结构，即外胚层（ectoderm）、中胚层（mesoderm）和内胚层（endoderm）。其中，中胚层经过进一步分化形成轴旁中胚层（paraxial mesoderm，PM）、间质中胚层以及侧板中胚层（lateral plate mesoderm，LPM）［33］。间质中胚层会相继形成3种肾脏结构，分别为前肾、中肾和后肾。绝大部分前肾和中肾会在胚胎发育的过程中退化，中肾管（nephric duct，ND，又称mesonephric duct）会被保留，后肾则会发育成人体永久肾。
作为肾脏祖细胞群体，后肾间质（metanephric mesenchyme，MM）以及输尿管芽（ureteric bud，UB）都源自间质中胚层。间质中胚层前后端存在着明显的区分，可分为前端间质中胚层（anterior intermediate mesoderm，AIM）和后端间质中胚层（posterior intermediate mesoderm，PIM）［33］。前端间质中胚层会形成中肾管，后端间质中胚层会形成后肾间质。在肾脏器官发生过程中，后肾间质会分泌胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）作用于中肾管，中肾管近泄殖腔端会萌出一盲管，此即为输尿管芽［34］。输尿管芽会伸入后肾间质，伸入的部分会被一些后肾间质细胞所包绕，这些细胞构成了帽状间质（cap mesenchyme，CM）。帽状间质细胞能够发育形成肾单位，而帽状间质周围的后肾间质细胞将会发育成肾脏的基质和血管成分，包括肾小球的毛细血管。输尿管芽顶端细胞产生的Wnt9b因子会驱动帽状间质发生间质-上皮转化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET）［35］，之后会形成肾泡（renal vesicle，RV）。肾泡经过伸长、分裂形成S形肾小管，之后经过进一步发育演化形成完整的肾单位结构［36］。同时，后肾间质会产生GDNF以促进输尿管芽前端不断分支，发育成集合管、肾盏以及肾盂，尾端则发育成输尿管。后肾间质与输尿管芽之间相互作用，不断发育分化，最终形成肾脏。
2.多能干细胞来源的经典构建方案
自人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）和人诱导多能干细胞（human-induced pluripotent stem cells，hiPSCs）发现以来，体外对人多能干细胞（human pluripotent stem cells，h PSCs）进行诱导分化以生成特定组织或器官的研究已经有了长足进展。人多能干细胞来源的肾脏类器官的构建方案也随着研究方法和技术等的进步逐渐成熟。
Atsuhiro Taguchi等［37］于2014年首次描述了人诱导多能干细胞来源的肾脏类器官的构建与培养。研究者们首先通过小鼠胚胎干细胞在体外构建并鉴定了3D后肾间质结构，在此基础上，使用人诱导多能干细胞构建并鉴定了人后肾间质的3D结构。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）以及活化素（Activin）对于诱导人多能干细胞形成中胚层细胞十分重要，因此，在诱导的初始24小时，向无血清培养基中添加了0.5 ng/m L BMP4因子和10μM Y-27632（Rho激酶抑制剂，有助于细胞存活）以诱导形成拟胚体（embryoid bodies，EBs）。接下来的两天时间里，研究者们用20 ng/m L FGF2和1 ng/m L Activin A以诱导形成上胚层。随后，中胚层细胞的诱导形成即是采用了高浓度Wnt激动剂（CHIR99021，10μM）和1 ng/m L BMP4，诱导时间为6天。而从中胚层细胞到后端间质中胚层细胞的诱导则是采用了10 ng/m L Activin A、3 ng/m L BMP4、低浓度的Wnt激动剂（CHIR99021，3μM）以及0.1μM视黄酸（retinoic acid，RA），该诱导过程持续3天。最后，用5 ng/m L FGF9和更低浓度的Wnt激动剂（CHIR99021，1μM）诱导后肾间质的形成。至后肾间质形成，诱导时间共计14天。同时，在后肾间质与小鼠胚胎脊髓共培养的情况下，能够看到大量的肾小管细胞和足细胞形成。免疫荧光染色结果显示，在诱导第14天时，大量细胞存在肾单位祖细胞标志物的表达，这些标志物包括WT1、PAX2、SALL1和SIX2。
几乎与此同时，Minoru Takasato等人［38］报道了人类胚胎干细胞细胞系来源的肾脏类器官的体外诱导方案，阐释了一种可分为3个阶段的诱导方式。
第一阶段为诱导原条的形成。通过测试不同浓度的Activin A和BMP4的组合，发现高浓度BMP4（30 ng/m L）与低浓度Activin A（10 ng/m L）的组合能够很好地诱导人类胚胎干细胞向后端原条分化。同时，研究者们发现较高浓度的CHIR99021（大于7μM）也可以起到同样效果，诱导产生的组织结构也相对高表达后端原条的标志基因MIXL1和T。
第二阶段是诱导原条向间质中胚层分化。第一阶段诱导完毕时，原条中虽然出现了间质中胚层的标志物之一OSR1的表达，但是并没有出现其他间质中胚层标志物，如PAX2和LHX1的表达。因此，可能还需要一些生长因子的帮助以诱导分化，例如FGF信号因子。由于FGF9会在间质中胚层和轴旁中胚层中表达，同时，FGF2/BMP7因子或FGF9因子对于后肾间质的体外培养起支持作用。进而研究者们对FGF信号因子家族中的3个因子（FGF2、FGF8和FGF9）进行了探究，观察它们是否能够诱导后端原条向间质中胚层分化。在诱导形成后端原条的基础上，用200 ng/m L FGF2、FGF8或者FGF9因子和1μg/m L肝素（heparin）诱导分化4天。结果显示，FGF2或FGF9能够使OSR1、PAX2和LHX1在超过80%的PAX2阳性细胞中共表达，但FGF8不能。这说明FGF2或FGF9可以较好地诱导间质中胚层的形成。
第三阶段是诱导后肾间质和输尿管芽的形成。视黄酸能够促进输尿管芽的萌发，视黄酸和BMP7在肾脏谱系细胞的诱导中发挥着重要作用，而FGF9能够在体外维持小鼠肾单位祖细胞的状态。因此，在第6～17天采用200 ng/m L FGF9、50 ng/m L BMP7、0.1μM视黄酸和1μg/m L肝素的组合以诱导后肾间质和输尿管芽的形成。结果显示存在后肾间质的特征标志基因SIX2、WT1、GDNF和HOXD11以及输尿管芽的特征标志基因C-RET和HOXB7的表达。这表明后肾间质和输尿管芽的诱导是成功的。
同时，Minoru Takasato等还验证了另一种诱导路线。诱导的前两天用8μM CHIR99021进行诱导，第3～12天用200 ng/m L FGF9和1μg/m L肝素进行诱导，之后不使用任何生长因子。这种诱导方式也能成功诱导形成所有主要的肾脏细胞类型。(https://www.daowen.com)
与2D培养相比，采用3D培养的肾脏组织其自组织化能力更强。研究者们通过CHIR99021-FGF9诱导路线，在诱导第18天时将细胞团消化为单细胞后转为为期4天的3D培养，结果显示形成的肾脏类器官与正常小鼠胚肾（embryonic day 13.5，E13.5）的自组织化能力没有明显区别。染色结果同样显示，不仅能够观察到ECAD＋PAX2＋的输尿管芽以及包绕在其周围WT1＋PAX2＋的后肾间质，也能观察到JAG1＋ECAD＋的肾泡。
在此基础上，Minoru Takasato等［39］于2015年报道了人诱导多能干细胞来源的肾脏类器官的构建方案。该方案首先通过单层培养的方式，在最初4天采用8μM CHIR99021进行诱导形成原条，之后3天用200 ng/m L FGF9和1μg/m L肝素进行诱导形成间质中胚层。接着转移至类器官培养体系，类器官培养体系形成后立即使用5μM CHIR99021对类器官培育1小时，从而产生一种类似于脉冲刺激的效果，促进类器官的生长。CHIR99021刺激后用含200 ng/m L FGF9和1μg/m L肝素的培养液进行培养，培养5天后，不再添加任何生长因子。在类器官培养体系下培养18天时，成功在类器官中诱导出了集合管（GATA3＋ECAD＋）、早期远端小管（GATA3-LTL-ECAD＋）、早期近端小管（LTL＋ECAD-）以及肾小球（WT1＋）结构。并且，在刚开始采用CHIR99021进行诱导时，CHIR99021的诱导时间越长（最长5天），经过随后的FGF9诱导之后，在诱导第7天时形成的HOXD11阳性的后端间质中胚层细胞越多。
Ryuji Morizane等［40］于2015年报道了一种人多能干细胞来源的肾单位祖细胞（nephron progenitor cells，NPCs）诱导方法，并且能够形成肾单位样的肾脏类器官结构。在对HDF-α人诱导多能干细胞诱导的前4天，首先使用10μM CHIR99021诱导形成原条，紧接着用Activin诱导3天，然而在Activin诱导结束时，细胞中虽然产生了HOXD11表达，却缺少WT1的表达，因此研究者们认为这种诱导方式并没有成功诱导出后端间质中胚层。对比人类胚胎干细胞和人诱导多能干细胞经过CHIR99021诱导4天后的结果，发现人诱导多能干细胞表达了后端原条和侧板中胚层的标志物FOXF1。而后端原条能够被BMP4梯度信号诱导，故研究者们假设CHIR99021可能会诱导HDF-α人诱导多能干细胞内源性的BMP4产生，从而使其向后端原条分化后向侧板中胚层分化。因此，研究者们在10μM CHIR99021的基础上添加了低剂量（5 ng/m L）的BMP4的拮抗剂Noggin因子。这使得在第4天时，诱导产生的细胞会表达T和TBX6，但不表达FOXF1，即仅表达后端原条的标志物。随后用10 ng/m L Activin诱导形成WT1＋HOXD11＋的后端间质中胚层细胞，且诱导效率达到了80%～90%。接下来为了让后端间质中胚层继续分化形成后肾间质中的肾单位祖细胞，研究者们采用FGF9进行诱导。研究者们使用5～200 ng/m L间不同浓度梯度的FGF9进行实验，发现FGF9处于较低浓度（10 ng/m L）时即可以高效地诱导形成SIX2阳性的细胞，其诱导效率可以达到90%，且诱导时间仅为1～2天。这些SIX2阳性细胞同样表达一些后肾间质中肾单位祖细胞的经典标志物，如SALL1、WT1、PAX2和EYA1。在第10～14天，如果仍以10 ng/m L FGF9处理，那么有些肾单位祖细胞便会下调SIX2的表达，分化形成PAX8＋LHX1＋的肾泡样细胞群落。如果在第10天时去掉FGF9因子，这些肾泡样结构会进行扩展和延伸，染色结果显示，这些结构中存在LTL＋CDH2＋的细胞以及NPHS1＋PODXL＋的细胞，分别类似于近端小管细胞以及足细胞。因此，在诱导的第10天时，去除外源因子能够让人多能干细胞来源的肾单位祖细胞分化形成肾单位早期上皮结构。同时，为了验证3D培养条件能够促进这种上皮结构的形成。在第10天时，去掉FGF9因子后，研究者们将肾单位祖细胞转移至圆底超低吸附培养基培养1周，肾单位祖细胞形成了3D球状聚集结构。染色结果显示在第16天时，存在LTL阳性的小管细胞和NPHS1＋PODXL＋WT1＋的细胞。在转移至3D培养后，为了提高诱导形成肾泡结构的效率，研究者对大量生长因子进行了筛选，发现用10 ng/m L FGF9处理的同时，添加3μM CHIR99021处理2天，也就是第9～11天，能够显著提高SIX2表达下降的PAX8＋LHX1＋细胞的比例约为76%。第11天时有较明显的PAX8＋LHX1＋LAM-的管前聚集体结构，至第14天时，出现了较明显的PAX8＋LHX1＋LAM＋的肾泡结构。14天之后，去除外源FGF9因子，肾泡结构能够自发地延伸形成上皮肾单位结构，包括肾小球足细胞（NPHS1＋PODXL＋）、近端小管（LTL＋CDH2＋）和髓袢（CDH1＋UMOD＋BRN1＋）。由此，经过总共21天的分化，肾单位样的类器官结构就此形成。
3种较为经典的肾脏类器官诱导方案简略图如图6-3所示。
图6-3 3种经典的肾脏类器官诱导方案简图［37，39，40］
3.多能干细胞来源的其他构建方案
在这些较为经典的肾脏类器官诱导路线的基础上，后来的研究者也进行了一些改进和发展。例如，传统的人多能干细胞来源的肾脏类器官能够被诱导产生肾小球样和肾小管样结构，但是这些在静态培养基中诱导出的类器官结构多是无血管或未成熟的。因此，Kimberly Homan等［41］就于2019年报道了一种在微流控组件中对类器官进行流动性培养的方法。这种方法不仅提高了内皮祖细胞的形成效率，而且产生了可灌流的被壁细胞包围的血管网络。此诱导方案大体上与2015年Ryuji Morizane等报道的相同。前4天的诱导因子为3～10μM CHIR99021和100～500 n M dorsomorphin（一种ATP竞争性的AMP依赖的蛋白激酶抑制剂）的组合。第4～7天同样为10 ng/m L Activin A诱导。第7～8天用10 ng/m L FGF9诱导，至第8天，后肾间质诱导形成。第8～10天转为悬浮培养，诱导因子选用10 ng/m L FGF9与2.5μM CHIR99021的组合。至第11天，诱导形成管前聚集体时，转至微流控组件中，先采用会产生较低流体剪切力的培养液流速（0.04 m L/min）进行培养。第12天时，采用会产生较高流体剪切力的培养液流速（1～4.27 m L/min）进行培养。第11～14天所用的培养液为含10 ng/m L FGF9以及1.5%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的类器官培养基。而从第14～21天的培养过程中，培养液为含1.5%胎牛血清的类器官培养液，不添加任何额外生长因子。第21天时，在体外观察到了MCAM＋PECAM1＋的血管网络。并且，相对于静态培养和在低流体剪切力环境下的培养，高流体剪切力能够明显促进血管网络的形成。KDR阳性的细胞也即内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）会转化为MCAM阳性的细胞，并最终转化为成熟的PECAM1阳性的血管内皮细胞。KDR阳性的内皮祖细胞在体外能够诱导形成SIX2＋PAX2＋SALL1＋的肾单位祖细胞并且可以分化形成肾单位上皮细胞。在高流体剪切力环境下，KDR阳性的内皮祖细胞占类器官总细胞数的11.2%，而在静态培养条件下，该比例为4.25%。相关结果表明，流动的液体环境能够促进肾脏类器官中管状上皮的成熟和形态发生，而且高流体剪切力对肾小球血管形成起到了一定的促进作用，并使肾脏类器官形成了更成熟的足细胞以及肾小管区室。
Kohei Uchimura等［42］于2020年首先根据前人的诱导方案分别诱导出了人多能干细胞来源的前端间质中胚层和后端间质中胚层，之后将二者合并，最后诱导形成了带有集合管的肾脏类器官。诱导GATA3阳性的前端间质中胚层的方案源自Atsuhiro Taguchi等［43］于2017年报道的工作，诱导形成HOXD11阳性的后端间质中胚层的方案源自Haojia Wu等［44］于2018年报道的工作。在第7天时，将二者消化成单细胞后按前端间质中胚层∶后端间质中胚层为1∶1或3∶1的比例混合，之后在类器官培养体系中，先用5μM CHIR99021脉冲刺激1小时，接着采用200 ng/m L FGF9、1μg/m L肝素、10 ng/m L GDNF、100 n M视黄酸和10 ng/m L表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）的因子组合培养5天。随后的13天里，类器官将在含10 n M醛固酮（aldosterone）、10 n M精氨酸加压素（arginine vasopressin，AVP）以及100 n M K252a（一种神经营养受体酪氨酸激酶抑制剂）的基础培养液中或仅用基础培养液进行培养。对比之下，在培养的第26天时，研究者们发现醛固酮和精氨酸加压素能够促进集合管细胞形成，包括AQP2＋SCNN1G＋的主细胞（principal cells）和AQP6＋ATP6V1B1＋的闰细胞（intercalated cells）。并且，研究者们通过单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）对细胞类型和成熟度进行了阐释，测序结果同样表明此诱导方案能够产生大量的集合管细胞，占总细胞数的28.5%。同时，与胎儿和成人的主细胞相比，结果表明诱导形成的主细胞与胎儿主细胞特征更为接近，而与成人主细胞差异很大。而且，相对于Minoru Takasato方案诱导形成的类器官中的主细胞，Kohei Uchimura等诱导形成的主细胞成熟度更高。
4.成体干细胞来源的构建方案
除多能干细胞之外，成体干细胞（adult stem cells，ASCs）也可以被诱导形成肾脏类器官。成体干细胞来源的类器官培养方案虽然在肝脏、前列腺、胃、结肠等许多器官中已经有了较多相关报道，但是在肾脏类器官研究领域却少有报道。Frans Schutgens等人［45］于2019年报道了一种人肾脏皮质组织成体干细胞来源的肾小管上皮类器官（tubular epithelial organoids，Tubuloids）的培养方案。首先对皮质组织进行消化，之后将消化获得的组织碎块与减生长因子基质胶混合并于特定培养基进行培养。其中，该培养基添加的特定因子包括10%Rspo1条件培养基、50 ng/m L EGF、100 ng/m L FGF10、10μM Y-27632、5μM A 83-01（TGF-β通路ALK4/5/7抑制剂）以及0.1 mg/m L primocine（一种原代细胞抗生素）。结果显示，在每周传代一次，每次按1∶3的比例进行传代的条件下，类器官可以进行至少20次传代（大于6个月），并且在此期间可以保持正常的染色体数目。随后，他们通过转录组测序（RNA-seq）对此培养体系所形成的肾单位成分做了进一步鉴定。结果显示，在转录组层面，内皮细胞的标志物（PECAM1、CDH5、FLT1）、间质和平滑肌细胞的标志物（MEIS1、CALD1、PDGFRB）并不表达，但上皮细胞标志物（PAX8、EPCAM）高度表达。同时，研究者们发现成体干细胞的标志物（SOX9、PROM1）表达增加，但是肾脏发育过程中的两个祖细胞标志物（SIX2、LGR5）并不表达。而且，能够观察到近端小管标志物（ABCC1、ABCC3、ABCC4、SLC22A3、SLC40A1）高度表达。此外，也观察到了一些髓袢标志物（CLDN10、CLDN14）、远端小管标志物（PCBD1、SLC41A3）以及集合管标志物（CDH1、GATA3、AQP3）的表达，但并没有观察到足细胞标志物（WT1、PODXL、NPHS1）的表达。这些结果说明，他们所培养构建的肾小管上皮类器官具有一定的干细胞特征，且缺少体内不能再生的细胞类型，如肾小球足细胞。