10.2.1 非定向分化脑类器官
与神经诱导“默认模型”一致，早在20多年前，研究人员发现鼠或人胚胎干细胞在无外源抑制因子（如血清成分）的条件下分化时，可自发建立神经谱系命运［1-3］。而即便在2D培养条件下，神经干细胞也体现出自组织倾向，比如形成典型的、模拟神经管组织的玫瑰花环状结构［2］。这些早期的干细胞神经分化研究，极大加快了人脑体外建模、脑疾病细胞治疗等领域的探索。相关的神经分化技术，也从早期的神经外胚层随机分化，快速发展至针对特定谱系的定向分化，如多巴胺神经元、抑制性中间神经元等。
从人脑体外建模角度，2D分化体系与真实大脑仍存在非常大的差异。这些差异体现在：①2D分化能重现的细胞谱系类型往往比较单一，且难以实现长时期的培养，比如持续数月甚至一年以上；②2D分化虽然能体现简单的细胞自组织，比如神经干细胞可自组织形成玫瑰花环样结构，但仍不能重现更复杂的脑组织3D结构；③以上在细胞构成、组织结构方面的本质差异，决定了2D培养其实难以呈现复杂的脑组织功能。因此，如何发展下一代人脑体外模型，从而更真实地模拟人脑，可以说是该领域发展的重大需求和必然方向。
神经分化研究从2D至3D发展的旅程中，无血清拟胚体分化方案的建立扮演了重要角色。其中，发表于2008年的研究表明，人胚胎干细胞在基于3D拟胚体分化方案下进行神经外胚层诱导，结合胞外基质成分的处理（如基质胶matrigel），即可自组织形成类似于胚胎脑的结构：比如其中包括由神经干细胞构成的脑室样区域，和基底侧由分化的神经元组成的皮质板样区域［4］。该工作虽然并未以类器官命名分化的神经组织，但可以说为脑类器官技术的发展奠定了重要基础。当然，与后期建立的脑类器官相比，该工作也并未开展持续的3D培养（培养过程中拟胚体被铺回至玻片），因此可归纳为介于2D与3D之间的培养方案。至2011年，针对神经系统的完全3D培养模型——视杯类器官——首次成功建立，神经类器官技术随后也开始进入快速发展阶段。
2013年，非定向分化脑类器官（cerebral organoids）首次报道［5］，该模型可能是大家最为熟知的脑类器官类型。非定向分化脑类器官的构建，也主要基于早期胚胎发育过程中神经外胚层发生的“默认模型”原理，即基于拟胚体无血清3D培养，在无其他外源因子引导的条件下，由多能干细胞自发分化为神经外胚层，并形成3D自组织结构。我们可将非定向分化脑类器官的基本构建流程简要归纳如下（图10-2）。
图10-2 脑类器官的基本构建流程
1.人多能干细胞的培养
目前已成熟建立的脑类器官方案主要是基于多能干细胞开展分化。多能干细胞类型，可以是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。其培养条件包括无滋养层培养，或依赖于滋养层细胞（如鼠胚胎成纤维细胞）的培养，其中，无滋养层培养方案对开展脑类器官构建更为便利。无论采用哪种培养方案，保证多能干细胞的质量是成功构建脑类器官的基础。这里的质量控制，主要涉及细胞多能干性（如是否存在自发分化细胞、干性标记物表达、分化潜能鉴定）、病原体污染（尤其是支原体、衣原体污染等）、遗传稳定性（如是否存在染色体畸变）等。
2.拟胚体的构建(https://www.daowen.com)
待传代的多能干细胞经酶消化后，可用于形成3D拟胚体，即由多能干细胞重聚形成的球体。目前常用的消化方式包括两类：通过酶处理（如accutase）解离多能干细胞克隆、制备单细胞悬液，以一定的细胞密度铺板重聚形成拟胚体；或通过酶处理（如dispase）将多能干细胞克隆整体脱离培养皿表面，碎片化克隆后（如通过缓慢吹打），让克隆团块重聚形成拟胚体。两种方案均需要使用超低吸附培养板，或未经细胞培养表面处理的培养皿（如petri dish）。两种方案也均可考虑使用ROCK通路抑制剂，如Y-27632，以促进多能干细胞细胞存活、重聚。另外，在经典的非定向分化脑类器官方案里，早期拟胚体的培养液即多能干细胞培养液。
3.神经上皮诱导
培养数天的拟胚体随后将转移至神经诱导培养液中，以建立神经外胚层分化。我们上面提到，该策略依赖神经发育“默认模型”原理。因此，需要注意此处的神经诱导液主要是提供细胞生长所需的基本营养成分，其中并不含有特定的神经诱导因子。在该培养条件下，拟胚体中的细胞将自发分化为神经外胚层谱系。而正是由于该过程不可避免存在一定的随机性，非定向分化脑类器官可能出现较高的样本间差异。当然，后续的研究表明，通过生物材料等的辅助，可优化非定向分化脑类器官的稳定性，并在类器官长期成熟过程中实现更理想的皮层分化［6］。
4.神经上皮扩增
除了神经上皮的自发诱导，非定向分化脑类器官构建的另一关键点是基质胶包被。我们知道，胞外基质是参与神经发育的重要细胞外组分。为引入该组分，典型的方案是在培养过程中添加基质胶（matrigel）——一种由小鼠肉瘤细胞分泌的基底膜基质材料。基质胶添加的方式，可以是固态包被，或者将基质胶以一定浓度稀释至培养液中。非定向分化脑类器官经典的做法是固态胶包被，即将拟胚体置于基质胶液滴中央，待液滴固化为凝胶后，悬浮培养包裹于基质胶中的拟胚体。该方案可快速实现神经上皮的扩增和折叠。
5.脑类器官的长期培养
经历了上述在静止、悬浮培养条件下对神经上皮组织的诱导和扩增后，样本将被转移至旋转培养环境，以便于实现更长期的培养。早期的非定向分化脑类器官采用了生物反应器（比如带有磁力搅拌器的培养瓶）以实现旋转培养。该方案的缺陷是难以实现多组不同样本的高通量培养。为简化培养装置、提高培养通量，随后建立的替代方案是以水平摇床的形式，在低吸附培养板/皿中实现样本的悬浮培养。从发育状态上，培养自水平摇床和生物反应器的脑类器官间并无明显差异。此外，也有研究采用静态培养的方式实现脑类器官的长期成熟。由于静态培养时气体、养分交换效率可能受限，如何维持神经组织的长期健康发育尤其值得关注；对应的常用优化策略，包括控制脑类器官的大小、提高培养环境中的氧浓度等。
通过以上分化流程，即可建立典型的非定向分化脑类器官。