11.1.2 视网膜类器官的构建
1.视网膜类器官的培养
视网膜类器官是由干细胞分化而来的类似于视网膜的3D结构，模拟了视网膜的结构，包含大多数视网膜细胞类型。当前，常用的用于视网膜类器官分化的细胞包括小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，小鼠ESCs）、人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）和人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）。
2006年，Deepak Lamba等通过2D贴壁的方法，将人ESCs在体外分化为感光细胞前体和感光细胞，其中约12%细胞表达感光细胞前体标记蛋白CRX，约5.75%细胞表达视杆细胞标记蛋白NRL，极少数细胞表达视锥细胞标记蛋白S opsin和视杆细胞标记蛋白RHO，然而这种方法产生的光感受器的比例太低［4］。2008年，Fumitaka Osakada等在分化体系中增加了视黄酸（retinoid acid，RA）和氨基乙磺酸（taurine），大幅增加了表达RHO+感光细胞的比例［5］。在经过200天的贴壁分化后，约10%的细胞表达了RHO，10%的细胞表达了S opsin，10%的细胞表达了L/M opsin。然而，这种感光细胞的比例仍远小于正常的人视网膜。随着再生医学的发展，分化体系逐渐由2D贴壁分化模式向3D悬浮类器官分化模式转变。2009年，Jason Meyer等用贴壁与悬浮结合的方法将hiPSCs分化为胚状体，随着时间的推移，视网膜和感光细胞相关基因在其中逐渐表达。在进行80天的悬浮培养后，能检测到感光细胞标记蛋白RECOVERIN和opsin表达［6］。Yoshiki Sasai及其团队最先利用小鼠ESCs在体外模拟视网膜发育，形成视网膜类器官。在培养方案中，视网膜类器官的形成是通过在无血清悬浮条件下，在96孔板中快速聚集一定数量的分离的小鼠ESCs（约3 000个细胞/孔），从而形成胚状体（embryo bodies，EBs）［3］。此外，添加细胞外基质（extracelluar matrix，ECM）成分（例如基质胶Matrigel）帮助EBs逐渐形成刚性连续的神经上皮细胞，这些神经上皮细胞在培养一周内外翻并表达Rax和Pax6等眼区部位的转录因子。与体内视网膜发育进程相一致，小鼠ESCs分化为眼杯包括4个阶段：第一阶段是视泡结构外翻并呈半球形；第二阶段是视泡的远端部分逐渐变平；第三阶段中，神经视网膜和视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）区域之间的接合处（称为铰链）的角度慢慢变窄，甚至成为锐角；第四阶段中，神经视网膜上皮开始作为一个顶部凸起的结构扩展，通过渐进性凹陷形成杯状。这些视杯状结构被分离出来后，可以单独分化为神经视网膜，其中包含带有感光细胞的外核层、内核层、双极细胞（Chx10+、Pax6-）和无长突细胞（Pax6+、Calretinin+）以及Müller胶质细胞（Cralbp+），神经节细胞层与视网膜RGCs（Brn3+、Pax6+、Calretinin+）。此外，视网膜类器官可以自发获得与体内发育中的视网膜相当的背腹侧（dorsal-ventral）极性。2012年，Joseph Phillips等报道人血液来源的iPSCs可以分化为视网膜类器官，其中包含多种视网膜细胞，如视网膜RGCs、无长突细胞、双极细胞、视锥细胞和视杆细胞等，这为基于hiPSCs的视网膜分化培养研究提供了方便的供体细胞来源［7］。在Meyer的研究基础上，2014年，Xiufeng Zhong等改进了分化系统，通过2D与3D相结合的方法将hiPSCs分化成具有层状结构的视网膜类器官［8］。该方案中，hiPSCs生长到接近融合，细胞被消化制成漂浮的聚集体，形成EBs，一段时间后重新进行贴壁培养形成视网膜神经上皮。该结构可以从孔的底部单独解剖，也可以在以网格模式划线后，收集全部的悬浮体，接下来对长期悬浮培养的视网膜类器官进行分选应用。其分化的时空顺序类似于体内视网膜的发育，并且在第27周分化出了感光细胞外段的膜盘结构，并且表现出光反应特征。
感光细胞退化是视网膜退行性疾病的常见表现，视锥细胞对人类的多色视觉和高分辨率的中央视觉尤为重要，因此，科研人员一直在探索如何在视网膜体外分化过程中产生更多的视锥细胞。视锥细胞根据光谱吸收特性的不同，可以被分为三类：蓝锥细胞（对短波长光敏感，即S锥细胞）、绿锥细胞（对中波长光敏感，即M锥细胞）和红锥细胞（对长波长光敏感，即L锥细胞）。研究已经证明，早期低水平的甲状腺激素T3信号促进S细胞的分化，而晚期的高水平甲状腺激素信号促进L/M细胞的分化。另外，使用重组的人类COCO蛋白抑制BMP、TGF-β和Wnt信号通路，也可促进S型视锥细胞的产生。在2014年研究基础上，Xiufeng Zhong从分化系统中去除视黄酸，使视网膜类器官中产生了更多的L/M型视锥细胞。
hiPSCs诱导分化产生视网膜类器官的效率也备受关注，因为这将决定后续研究的基础。在2020年，Cameron Cowan等报道，由iPSCs产生视网膜类器官的潜力是有差异的。这可能是由于不同iPSC的遗传起源、表观遗传和转录组状态不同所导致。他们尝试了23个iPSCs细胞系，筛选出能高效产生视网膜类器官的细胞系。另外，类器官产生的第一步是形成EBs，EBs的尺寸大小也影响视网膜类器官的分化效率。视网膜分化方法中控制EB的尺寸大小，例如Cameron Cowan等人使用96孔板限制细胞密度来控制EBs的尺寸，开发的琼脂糖微孔阵列播种和刮取法大大提高了诱导分化的效率并降低了时间成本，同时他们的结果表明约200～300微米的EBs形成视网膜类器官的效率较高［9］。(https://www.daowen.com)
2.人、鼠视网膜类器官异同
小鼠和人类干细胞来源的视网膜类器官在发育进程和成熟度上有着明显差异。这是因为小鼠的ESCs来自囊胚的内部细胞团，而h ESCs来自稍晚的外胚层。据报道，小鼠的ESCs可以通过添加低浓度的敲除血清替代物（knockout serum replacement，KSR）有效地进行视网膜分化，而hESCs需要添加较高的浓度（10%～20%）的KSR。此外，与小鼠ESCs不同，h ESCs在传统U形底孔中生长时，其重新聚集缓慢且往往不完整，导致聚集的EBs大小不均一，从而导致分化效率的差异。因此，h ESCs常被放在V形底培养板中进行培养。相关的改进措施包括添加促进细胞聚集的培养基或使用blebbistatin。在体外视网膜分化过程中，也观察到小鼠和人视网膜类器官的结构和形态发生差异，包括早期视杯阶段神经视网膜（neural retina）的大小（小鼠约为250～300微米，人类约为550微米）和厚度（小鼠约为60～80微米，人类约为120～150微米）存在差异。
小鼠和人类干细胞来源的视网膜类器官在视网膜发生时间上有显著差异。虽然小鼠视网膜类器官（第7天）和人视网膜类器官（第5～18天，具体取决于培养系统）的早期视网膜标志物（如Rax）的表达没有太大差异，但早期出生的神经元，例如Brn3+RGCs，在小鼠的类器官中在第16天出现，而在人的视网膜类器官中则在第24～54天出现，发育存在延迟。物种特异性差异在视网膜分化和成熟的后期阶段时更加明显：在小鼠第16～20天和人类的第120～150天与第180天，可以分别首次检测到视锥细胞和视杆细胞蛋白。在人类视网膜类器官中，视锥细胞的比例为12.4%～17.8%，明显高于小鼠的系统。
总的来说，尽管人和小鼠视网膜类器官的生成显示出相同的原理，但在人和小鼠干细胞来源的视网膜组织中观察到一些差异，这可能允许识别和研究视网膜发育过程中的物种特异性差异。虽然，小鼠视网膜类器官的培养时间显著缩短，但在研究哺乳动物细胞命运决定、组织模式和神经元成熟的基础研究中仍然是一种有价值的工具。