11.1.4 视网膜类器官的应用与展望
1.人视网膜发育模拟
哺乳动物视网膜发育进程目前主要是利用啮齿类动物模型，如小鼠和大鼠来开展研究。尽管这些研究使我们对视网膜发育的时间、分子机制和各种细胞类型有了深入的了解，但小鼠和人的整个发育过程存在显著差异。因此，啮齿类动物无法模拟人类视网膜的宫内发育过程。人类视网膜的发育时期从受孕后4周开始，直到出生后不久结束，这使得在人类身上研究这些过程在伦理和技术上都具有挑战性。此外，在体内的人类视网膜细胞无法被改造，这阻止了任何干扰正常发育细胞功能的研究。因此，利用视网膜类器官来模拟人视网膜发育尤为重要。
一些研究探讨了人类胚胎视网膜和视网膜类器官在发育过程中各自染色质开放状态和基因表达变化的差异。通过对不同发育阶段的人胚胎视网膜和视网膜类器官进行多组学分析，有研究发现人胚胎视网膜和类器官有着类似的重大发育转换阶段，并与染色质开放变动精准对应。然而，视网膜类器官在神经发育过程中的染色质开放度远远没有人胚胎视网膜复杂。单细胞转录组测序（single cell RNA sequencing，sc RNA-seq）可用来分析复杂群体中单个细胞的基因表达模式，并提供了前所未有的详细信息，包括细胞类别、亚型的转录组学和分子特征，以及器官发育和细胞命运决定过程中发生的微妙基因表达变化。研究发现人类视网膜与其他动物模型的视网膜在分子特征上有着显著不同。Yirong Peng等对来自猕猴中心凹和外周视网膜的超过100 000个细胞进行了sc RNA-seq，发现灵长类动物和小鼠之间的中间神经元亚型很保守，但RGC神经元亚型的基因表达有显著差异［12］。小鼠和灵长类动物成人视网膜中细胞亚型和功能的主要差异表明，这些细胞类型的发育程序可能存在类似的差异。利用sc RNA-seq研究，研究人员比较了视网膜类器官与胎儿和成人的视网膜分子特征［13，14］。研究发现体外类器官的发育速度与体内视网膜的发育速度非常相似，38周大的类器官的基因表达和细胞类型与新生的人类视网膜非常相似。此外，类器官转录组显示，尽管也存在具有中央凹基因表达模式的细胞，但类器官细胞类型组成与成人外周视网膜密切相关。Emily Welby等通过对人类胎儿L/M-opsin视锥进行sc RNA-seq，鉴定出在视锥发育过程中有93个基因表达存在差异。他们进一步分析了这些基因在视网膜类器官中分化的视锥细胞的转录组表达［15］。结果显示，类器官和胚胎视网膜的基因表达及其发育速率高度相关。例如，视锥标记物OPN1LW/MW和ARR3在12～14周的胎儿组织和14周的类器官中均被检测到。这些研究结果表明，视网膜类器官是模拟人视网膜发育的有效模型。
2.人视网膜疾病模拟
视网膜类器官也为研究人类视网膜疾病提供了一个强大的工具。视网膜退行性疾病（retinal degeneration，RD）是由视网膜神经元和（或）RPE细胞不可逆的功能障碍或死亡引起的，导致视力丧失，甚至失明。虽然人们在视网膜退行性疾病研究方面投入了巨大的努力，但除了为新生血管性年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）开发高效的抗血管生成治疗方法和为Leber先天性黑蒙（leber congenital amaurosis，LCA）开发基于基因治疗的治疗方法外，其他RD的有效治疗方法仍然有限。现在，视网膜类器官技术的应用现在不仅能够使研究人员研究遗传和环境因素对人类视网膜细胞健康的影响，还能测试针对这些破坏性因素的潜在保护措施。
在研究遗传性视网膜疾病方面，视网膜类器官有两个主要优势。一方面，干细胞系可以被基因改造，这样目标基因突变都可以在细胞中引入或纠正。自从CRISPR-Cas9首次被发现以来，研究人员已经能够以前所未有的效率将突变引入干细胞系的基因组。另一方面，可以将改造过的细胞系分化成视网膜类器官，并研究基因突变对人类视网膜细胞和其发育的可能影响。即使需要考虑的遗传性视网膜疾病涉及大量的基因，这项技术也使得在相同的基因背景下比较各种突变机制成为可能。例如，携带USH2A突变的视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）患者的角质形成细胞被制成iPSC系，并利用该系分化视网膜类器官。编码纤毛相关蛋白（包括参与纤毛生成的蛋白）的基因缺陷与许多遗传性视网膜疾病有关，包括LCA和RP等。感光细胞纤毛病已被证明难以在小鼠中建模；小鼠模型中受影响的细胞类型通常与患者中受影响的细胞类型不同，RD的发生率也不同。但是，患者源的iPSCs被分化为视网膜类器官，可以展现出感光细胞纤毛缺陷。CEP290基因编码对初级纤毛生成至关重要的蛋白质，20%的LCA患者携带该基因突变。将患者来源的iPSCs分化为视网膜类器官与对照患者的类器官相比，显示出感光细胞纤毛缺陷。在对照感光细胞中，CEP290蛋白定位在连接纤毛的底部，而在CEP290突变的类器官感光细胞中无法检测到。CEP290的缺失与纤毛数量和纤毛长度的显著减少相关。研究表明，由于患者的突变，分化中的感光细胞特异性的CEP290 m RNA异构体被错误剪接，而阻止CEP290剪接变异体（包括异常外显子）的反义寡核苷酸在第13周被引入类器官时恢复了纤毛的正常数量和长度。Deng Pan等2018年的研究中使用视网膜类器官研究特定基因突变对感光细胞功能的影响。来自3例不同RP患者的iPSCs（每个患者的RPGR基因都有独特的移码突变）分化为类器官［16］。他们比较了从携带致病突变的患者iPSCs产生的类器官和经过基因突变纠正的细胞系产生的类器官，发现患者的类器官中感光细胞形态和定位发生了改变。感光细胞纤毛长度、RHO表达和电生理都显示出缺陷。利用CRISPR-Cas9基因组编辑，患者的iPSCs中的RPGR突变得到了纠正，当该细胞系分化为类器官时，基本上感光细胞的分子和生理缺陷都得到了纠正，这提示RPGR纠正挽救了疾病表型。Adriana Buskin等也使用CRISPR-Cas9纠正了RP患者来源的iPSC系中的突变，该突变导致前m RNA加工因子PRPF31发生突变［17］。当这些编辑细胞分化为类器官时，剪接缺陷和基于纤毛的缺陷得到缓解，感光细胞发育正常。这些研究成功地关联视网膜疾病患者的基因型和表型，为利用基因编辑修复视觉的可行性奠定了一定的研究基础。
3.视网膜类器官移植
由于视网膜类器官分化方便且稳定，理论上我们可以产生无限的视网膜类器官，以及可移植的视网膜细胞。此外，与体内视网膜相比，视网膜类器官的视网膜细胞具有相似的分层结构和细胞—细胞连接。视网膜类器官既可以从患者来源的iPSCs产生，也可以从商业化的hiPSC系产生，并且比动物模型更具有生理学意义。因此，视网膜类器官已成为细胞治疗的可靠资源。MA09-hRPE细胞系是第一个进入临床试验的细胞系。在这项首次临床试验之后，其他几项试验将h ESCs/hiPSCs来源的RPE移植作为细胞悬液或片层进行移植。这些用于治疗视网膜退行性疾病的开创性细胞疗法试验的结果表明，将iPSCs来源的RPE供体细胞移植到眼部是安全的，没有显著的副作用，而且该手术可能保护接受治疗的患者免于进一步视力丧失。此外，两项临床试验使用体外扩增的人胎儿组织来源的视网膜前体细胞注射到玻璃体腔或视网膜下腔作为支持色素性视网膜变性患者的感光细胞的方法。鉴于这些针对视网膜退行性疾病的首次干细胞临床试验，人们对将视网膜类器官来源的感光细胞推向临床应用产生了极大的兴趣。将h ESCs或hiPCs来源的视网膜组织用于治疗的基本先决条件是改进和优化符合GMP的方案。Shelly Tannenbaum等人首次获得了GMP级别的hESC细胞系［18］。
（1）单细胞移植
单细胞移植的优点包括：①适用于针对某些特定细胞类型损失的靶向治疗；②可控制分离细胞的纯度和质量；③细胞在视网膜下空间能够扩散至更大的区域，增大了供、宿主细胞之间的接触面积。到目前为止，视网膜前体细胞、未成熟的感光细胞前体细胞和完全成熟的感光细胞已经被用于移植。其中，未成熟但不再分裂的、能在宿主视网膜中继续分化的感光细胞前体细胞被认为是最可行的供体细胞类型。对于细胞的选择和纯化，Jörn Lakowski等使用荧光激活细胞分选建立了从视网膜类器官和胎儿视网膜中富集感光细胞前体细胞的表面生物标志物组合（CD73+/CD29-/SSEA1-）［19］。这种标志物组合还可以去除有丝分裂活性细胞，以避免可能的肿瘤发展。Joseph Collin等发现CRX+表达感光细胞前体细胞可以大部分分化为早期视锥细胞，该细胞系产生了可移植的视锥感光细胞前体［20］。Darin Zerti及其同事将CRX-GFP标记的iPSCs从分化90天的视网膜类器官中分离出细胞并移植到终末期变性的rd1小鼠模型中［21］。研究发现高达1.5%的细胞整合到宿主外核层。
视网膜前体细胞也是移植的常见来源。Jennifer Chao等将100万个视网膜前体细胞注射到一种非人灵长类动物体内，并在3个月的时间里，在不需要免疫抑制的情况下，观察到延伸的轴突投射到宿主视网膜和视神经，但并未检测到明显的感光细胞整合［22］。然而，与薄片移植相比，单细胞移植缺乏完整性和机械稳定性，这降低了供体细胞存活率并限制了其在宿主组织内的进一步发育。大量注射的细胞通常聚集在视网膜下空间，只有一小部分会迁移到宿主视网膜，存在长期存活的问题。此外，感光细胞的定向分化也难以控制。
（2）移植视网膜类器官片
与单细胞移植相比，视网膜类器官片移植的优点是：①视网膜类器官片保留了完整的视网膜分层结构，更容易融入宿主视网膜；②神经间连接结构完整，移植组织存活率较高；③组织片提供了更好的机械支撑，为视网膜细胞的分化和功能提供了更好的微环境。Michiko Mandai等将视网膜类器官片移植到终末期rd1小鼠模型中，观察其光反应行为［23］。Satoshi Iraha及其同事将视网膜类器官片移植到免疫缺陷rd1小鼠模型中，移植组织显示出长期存活和成熟（第200～220天），同时研究观察到宿主-移植视网膜类器官片形成突触，并从视网膜整体检测到光反应［24］。视网膜类器官片被移植到食蟹猴和恒河猴体内，研究发现恒河猴在移植1.5年后轻度恢复了光知觉。
然而，这种方法的缺点包括需要高度训练的操作技能，并且与非晶状体移植相比，视网膜切口更大，因为视网膜类器官片需要以正确的方向平放到视网膜下腔。此外，视网膜类器官片的均匀性和视网膜细胞纯度对于避免未分化或非视网膜细胞污染导致的肿瘤发生或纤维化至关重要。虽然移植物形成视网膜层，但感光细胞经常形成称为玫瑰花结的球形结构，感光细胞外段位于中心，并与RPE断开。这可能与移植前类器官中可能形成的莲座状结构，以及移植过程中类器官碎片的创伤有关。
（3）移植RPE片和视网膜类器官片共移植
除了视网膜类器官片，RPE也是一种有前景的组织来源，用于移植和视力恢复。RPE在视觉中发挥着至关重要的作用，包括：①向感光细胞输送营养、离子和水；②在视循环中发挥重要作用；③防止光氧化和光吸收；④通过吞噬去除脱落的感光细胞外段膜；⑤分泌必需的细胞外分子（如层粘连蛋白、胶原蛋白和HA），以维持视网膜的完整性、功能和活性。部分研究使用h ESCs/iPSCs分化的RPE片（或“贴片”）在动物模型和临床试验中治疗视网膜退行性疾病。然而，这种方法在阻止疾病进展方面并没有成功。考虑到单纯RPE或视网膜类器官移植的性能有限，一些研究小组提出联合移植这两种组织的结合物可能提供增强的效果。早期研究发现，体外共培养的大鼠神经视网膜和RPE细胞通过增加视紫红质的合成促进了感光细胞整合和轴突生长。此外，与视网膜单独培养相比，共培养中观察到细胞凋亡减少、胶质细胞增生和谷氨酸合成增加。然而，由于RPE和视网膜类器官的培养条件不同，这两种组织的共培养通常是短期的，通常在几天的范围内。因此，将RPE和视网膜类器官共培养到准备移植的阶段是具有挑战性的。Biju Thomas等利用生物黏合剂（明胶、生长因子降低的基质胶和中黏度海藻酸盐）将视网膜类器官和极化RPE片材结合起来移植到免疫缺陷RCS大鼠视网膜下间隙，移植物可长期存活（高达6.5个月），在动物中可观察和视觉功能的改善［25］。
（4）生物材料支架移植(https://www.daowen.com)
研究人员还使用工程方法来实现视网膜重建。前期研究制造了一种以微米级精度图案化的超薄（30μm）可生物降解支架，可在一个直径为5 mm的支架上支持多层的干细胞分化而来的感光细胞，其中包含超过30万细胞，与人类黄斑面积相似。这种设计在体外降解速度较慢（长达30天）。然而，需要更多的研究来扩大生产、优化动物模型的递送策略和体内功能测试。
最后，为了评估移植的有效性，用动物模型进行了不同的移植后试验。这些研究中使用的宿主尽管丧失了感光细胞，但从视神经到视觉皮层的神经通路仍然完整。移植性能是移植组织在宿主视网膜内的整合、分化和产生功能的直接结果。因此，移植后测试通常侧重于检查以下性能（图11-3）：①行为测试对象的光和对比敏感性和视力；②视网膜和视皮层之间视觉通路的连通性与视网膜和脑电生理记录；③移植物和宿主组织之间的整合、分化和突触发生与OCT、组织学以及视网膜和突触标记物与功能结果的相关分析。
图11-3 视网膜类器官技术的一些潜在应用
视网膜类器官可用于（a）研究视网膜的发育；（b）视网膜疾病的基因治疗；（c）类器官片植入；（d）细胞移植；（e）模拟视网膜疾病；（f）进行药物筛选
4.功能性视网膜类器官展望
虽然近年来视网膜类器官技术领域取得了重大进展，但在体外构建高度复杂的哺乳动物视网膜仍然超出了现有工具的能力范围，目前仍不可能生成与成熟体内视网膜具有相同生化和生理特征的视网膜类器官。为了创造这样的类器官，未来的技术必须整合几个额外的特征，包括平滑肌细胞、脉管系统和小胶质细胞等免疫细胞。
（1）血管系统
制造3D类器官的主要挑战之一是维持细胞的长期活力，这在很大程度上依赖于获取营养物质和氧气。目前无法供应此类营养物质的原因是，类器官中缺乏内源性、工程化的血管系统或营养通道。没有血管系统，类器官的大小受限于氧气的扩散极限。这一问题可能通过应用新的技术方法来解决，例如支架孔隙度的优化、生物反应器、氧输送机制、视网膜芯片、血管化组织的3D生物打印和与中胚层前体细胞的共培养。
（2）小神经胶质细胞
小胶质细胞是视网膜主要的常驻免疫细胞，与Müller胶质细胞相互作用。小胶质细胞对视网膜的正常发育很重要，因为它们调节神经元存活和突触修剪。添加人白细胞介素34（interleukin 34，hIL-34）可使得hiPSCs分化为高纯度（＞90%）的小胶质细胞（i MGs）。i MGs表达小胶质细胞特异性标志物，在受刺激时释放细胞因子，并且能够吞噬细菌。当i MGs与视网膜类器官共培养时，i MGs可迁移到视网膜类器官中，倾向于分化成常驻的视网膜小胶质细胞，并同时诱导一些神经细胞的凋亡。
（3）视网膜类器官退行性变和类器官极性
人视网膜类器官在体外的成熟速度与人视网膜在体内的发育速度大致相当，但这一漫长的发育过程导致了类器官的退化。这种退化一般是由于缺乏营养或被动扩散不良造成的，主要发生在类器官内部。因此，在类器官的感光细胞达到完全成熟阶段之前，内部细胞已经逐渐消失，RGC细胞大量减少。与体内视网膜的天然杯状相比，视网膜类器官呈球形而缺乏极性。这种形状可能是由于悬浮细胞倾向于形成球形，周围细胞层分布均匀，这也阻碍了视网膜适当的极化组织发育。但是，极性发育是光学发育和外周—中心特化所必需的。因此，这一块还需要进一步研究。
（4）突触发生
视网膜突触在内、外网状层有序排列。这种结构可以有效地处理视觉信号。然而，在视网膜类器官的水平细胞、感光细胞和双极细胞的外丛状突触缺乏复杂的特征。目前，在视网膜类器官中尚未检测到双极细胞、无长突细胞和RGC之间的带状突触。这可能是由于内层，包括RGCs在一段时间后消失所致。
（5）视网膜通路
视网膜的一个基本功能特征是它能够以一种可被电生理学记录的方式区分不同的光刺激。这种能力源于视网膜由具有复杂连通性的不同细胞类型组成。然而，通过将体外视网膜类器官与体内视网膜组织进行比较，研究人员发现在突触、连通性和细胞类型等方面，视网膜类器官在形态和功能上远没有那么复杂。即使在长期培养中，视网膜类器官也无法产生和维持体内视网膜中发现的3个明确分离的核层。此外，视网膜类器官通常缺乏天然视网膜中感光细胞的复杂排列和复杂的突触连接，导致视网膜类器官不仅不能完全响应光刺激，而且缺乏视网膜通路。