11.1.3 视网膜类器官的鉴定
感光细胞的成熟需要产生高度特化的外段结构，以执行光响应和光转导级联反应。早期的2D和3D分化研究表明，小鼠和人视网膜类器官中一般缺乏可见的外段样结构，这表明体外条件未能完全再现感光细胞成熟所需的复杂发育环境。在视网膜类器官中随时间依赖性地添加视黄酸（在第10～14周，感光细胞发育的特定时期），可增加RHO的表达。反过来，在视锥发育的最佳条件可能需要下调RA含量。最后，即使在没有补充RA的情况下，类器官也可形成成熟的感光细胞。对视网膜类器官的转录组分析提示，视网膜类器官在第30～38周时达到稳定发育状态。在这个阶段，视网膜类器官能更精确地模拟体内发育，支持成熟结构的形成和突触生成。
视网膜类器官的功能评估可以通过多种方式实现，包括全细胞膜片钳、穿孔膜片钳、免疫组织化学和透射电子显微镜、钙离子成像、微电极阵列（multi-electrode array，MEA）和感光细胞离子通道膜特性（图11-2）［10］。
图11-2 视网膜类器官功能评估
1.全细胞膜片钳（whole-cell patch clamp）
一种记录细胞膜电位的技术，可以用于研究感光细胞的功能。全细胞膜片钳技术可以记录感光细胞的膜电位，进而研究其光敏性和动作电位等功能。全细胞膜片钳配置是通过在微吸管内增加足够的吸力以轻轻破裂细胞膜，允许细胞内液体和玻璃电极溶液变得连续和电耦合，进而可以测量细胞离子通道特性。
2.穿孔膜片钳（Perforated patch clamp）
穿孔膜片钳配置是通过将吸管贴附在细胞膜上，并使用成孔抗生素在细胞膜上制造孔来实现的。这样，即使在全细胞膜片钳配置中，也不需要用吸管液冲洗和稀释关键的细胞内生物分子就能测量离子通道特性。穿孔膜片钳与全细胞膜片钳的区别在于，穿孔膜片钳在细胞膜上所钻的孔道只能通过小的离子，因此该方法不会使细胞内容物稀释或丢失，明显减弱离子通道电流的rundown现象。此外，第二信使被保留在细胞内，这允许更长时间的记录，并有助于测量受内源性信号调节的离子通道特性。电压钳方法可以与全细胞和穿孔膜片钳配置一起使用，以分离和测量感光细胞的响应特性。
3.免疫组织化学（Immunostaining）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy）
正常的视网膜功能需要感光细胞与内核层二级神经元之间的突触传递。许多研究中使用免疫荧光染色，以证明光转导级联元素以及外网状层突触前和突触后成分的存在，而透射电子显微镜则用来提供感光细胞外段的解剖学证据。总的来说，这些技术可以为视网膜类器官可能具有功能提供间接证据。(https://www.daowen.com)
4.钙成像（calcium imaging）
钙成像能够可视化细胞内钙水平，这是一种间接测量神经活动的方法。当神经网络中的每个神经元被上游细胞激活时，突触连通性可以通过一系列钙运动模式来观察突触连通性。钙水平的变化可以用GCa MP6f等钙敏感荧光报告分子来检测，并通过双光子显微镜成像，探索细胞中的神经功能。
5.微电极阵列（MEA）
通过将分离的视网膜的RGCs侧放在一个微电极阵列上，研究人员可以对视网膜上RGCs进行大规模采样。阵列上的每个细胞外电极都可以检测到1或2个RGCs的细胞神经发放（spike）。通过不同的光刺激方案，多电极阵列记录评估下游信号，通过光诱发的RGCs神经发放模式的变化来测量由光诱发的感光活性。
6.感光细胞离子通道膜特性
感光细胞具有许多离子膜通道，用于维持它们的膜电位和调节光转导信号。其中，环核苷酸门控离子通道由1个通道孔和4个亚基构成（α或β亚基）。该类通道可以分为两类：环核苷酸门控离子通道（cyclic nucleotide gated，CNG）和超极化激活的环核苷酸门控（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated，HCN）通道。这些和其他离子通道的膜生理学结合光感受器形态可能表明一定程度的光感受器成熟，使其能够对光刺激做出反应。
Lingyun Li等使用膜片钳技术来检测视网膜类器官中感光细胞的细胞质膜特性和多种特征离子通道的功能成熟。他们选择了三个发育阶段的类器官：早期（90～120天）、中期（150～160天）和晚期（200～210天），使用全细胞电压钳模式测量光感受器中的CNG通道电流［11］。他们使用添加了cGMP的记录电极内液以帮助通道激活，并通过使用特异性的CNG通道阻断剂（+）-顺式-盐酸地尔硫（LCD），可逆地阻断CNG电流，从而实现对CNG电流的量化。他们发现，在诱导分化后期，感光细胞中的CNG通道显示出功能成熟，而在诱导分化的前期和中期则难以观测到。研究人员也通过添加HCN通道阻断剂ZD7288，表征了早期、中期和晚期类器官中类感光细胞HCN通道电流，结果也显示随体外培养时间而逐渐成熟。诱导分化后期的类器官中记录到的HCN电流与猕猴感光细胞HCN电流最相似，振幅为1/3～1/2。诱导分化培养300天后，对感光细胞的膜片钳记录也显示有其他离子通道成分存在，包括类似氯离子激活钙电流的电流瞬变（6/28），类似电压依赖钠离子通道活动的电位变化（2/11），这些都可以在成熟的灵长类光感受器中观察到。
7.突触连接
视网膜类器官功能成熟的一个关键因素是感光细胞响应光水平变化并将这些变化传递给下游的能力。免疫组织化学和透射电镜可证明成熟的类器官光感受器中有功能性带状突触。Cameron Cowan等筛选了23个hiPSCs系，发现有8个系形成了适当的视网膜层，并存活了100天。其中4个细胞系形成了理想的3个核层和2个突触层。通过免疫组织化学和透射电镜对内、外段、轴末端和带状突触的成熟类器官表征［9］。