14.3.2　分子生物学方法鉴定

除组织形态和组织特异蛋白鉴定外，还需要更多分子水平上的证据以提高鉴定的精准度，其核心目的是验证体外培养的类器官在遗传背景上与来源肿瘤组织具有很好的相似性，可以模拟体内药物反应。传统的手段是提取DNA后进行Sanger测序和提取蛋白后进行蛋白免疫印迹（western blot），验证关键基因在肿瘤类器官和来源组织的突变和表达水平是否一致。但是这种方法每次只能检测一种基因或一种蛋白，效率较低。随着高通量测序技术的普及应用，可供使用的方法越来越多，例如全外显子测序（whole-exome sequencing，WES）、转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）、全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）、目标区域捕获测序（target-seq）、DNA甲基化分析、基因表达微阵列（cDNA微阵列与DNA芯片）、基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）等。其中，WES凭借其全面性、有效性和极高性价比等优势，在类器官的鉴定中应用广泛。WES可发现碱基突变率、碱基突变类型占比、基因拷贝数、染色体的缺失与转位的差异，比对组织特征基因的序列，分析突变位点和类型，以及统计重叠率。研究者可依据研究的目的、费用、鉴定方法的可实施性等因素来选择适合的鉴定方法。在类器官培养的早期，基于样本采样量和成本的考虑，优先推荐HE染色和免疫组化，初步确定培养的类器官与来源组织的相似性。如果形态学验证合格，再考虑扩大培养类器官，并采样进行WES，鉴定类器官与来源组织在特征基因上的重叠率。如果研究目的需要更精准、全面的验证，可以考虑采用RNA-seq、WGS和DNA甲基化分析，专门分析某个靶点、某条信号通路或某个代谢途径的性状在肿瘤类器官中是否被保留，以供挑选符合药物筛选条件的类器官模型。若无条件进行WES、WGS等，也可采用短串联重复序列（short tandem repeats，STR）检测等验证方法以消除交叉污染对药物筛选的误导。

类器官除了可以作为研究肿瘤异质性的模型，也可被用于发现肿瘤进化的规律［38］。例如，Helen Yan等［12］发现胃异型增生的类器官和侵袭性胃癌类器官均涉及TP53和APC等常见早期驱动基因突变，但STK11和SMARCA4突变仅存在于侵袭性胃癌类器官中，这为肿瘤进展过程的揭示提供了线索。(https://www.daowen.com)

采用基因测序对类器官进行评估鉴定，较组织病理学的评估鉴定方式具有更高的精准度，且能获得肿瘤的分子谱表达模式，从而更好地捕获肿瘤内及肿瘤间的异质性，既有助于在后续类器官药物敏感性检测中分析分子靶向药物的疗效，又有助于类器官样本库大数据的完善和建立。但基因测序存在耗时长、费用相对高，目前用于类器官药物敏感性检测方面仍有滞后性及普及性欠佳的问题。