14.4.1 消化系统肿瘤类器官进展
1.结直肠癌类器官进展
结直肠癌是全球发病率第4和病死率第3的恶性肿瘤［42］，也是肿瘤类器官中开始研究最早和当下研究最火热的消化道肿瘤之一。在中国，结直肠癌仍然是最常见的消化道肿瘤之一。中国结肠癌和直肠癌患者5年生存率仅在50%左右。总之，结直肠癌发病率高，患者预后较差，给我国卫生医疗系统带来较大负担，是需要关注的恶性消化道肿瘤之一。
由于正常肠道组织的生长会影响肠癌类器官的生长，如何区分正常肠道组织和肠癌组织是肠癌类器官培养中的关键。约90%的肠癌存在WNT通路的突变，故肠癌类器官的培养基中无需添加WNT3a，而正常肠道类器官的生长中WNT3a则是必需的［5］。因此，通过不在培养基中添加WNT3a的方式能够实现将肠癌组织中的正常肠道和肿瘤组织进行分离。一项针对276例结直肠癌患者样本的全基因组分析研究发现，肠癌中超过94%的基因突变均属于以下5种致癌途径之一：WNT、TGF-β、PI3K、RAS-MAPK和TP53。与人正常肠道组织类器官相比，存在这些突变的肠癌类器官能在缺少一些因子如WNT3a、R-spondin-1和EGF的情况下生长［43，44］。目前肠癌类器官的培养成功率为70%～80%，标本可来源于手术样本、活检组织或肠癌转移灶穿刺样本［16，17］。
类器官技术被广泛应用于人胃肠道肿瘤的机制探索和转化性研究中。Ömer Yilmaz团队报道了基于结肠镜引导的小鼠远端结肠中黏膜注射的方法，该方法可实现快速有效地诱导原位肿瘤［45］。这些技术可用于CRISPR-Cas9工程小鼠肿瘤类器官或人类肿瘤类器官的种植，以模拟肿瘤进展的腺瘤-癌-转移过程。此外，消化道肿瘤类器官与CRISPR-Cas9技术的联合也被广泛应用在肿瘤发生和进展的基础研究领域［46-48］。
多项结直肠癌类器官的转化研究结果表明肠癌类器官能够较好反映原位肠癌组织的基因组改变、分子特征以及放化疗敏感性。Joshua Smith团队建立了包含65例直肠癌类器官的生物库，并通过药物敏感性测试发现了肠癌类器官对5-FU和FOLFOX方案敏感性与患者的无进展生存相关；类器官水平对X射线的敏感性与患者接受放疗前后内镜下的肿瘤退缩程度相关［17］。章真和华国强团队建立了局部进展期直肠癌类器官的生物库（组织来源于Ⅲ期临床研究CinClare），并且用肠癌类器官面积变化法证明了直肠癌类器官对5-FU、伊立替康和X射线中任一处理的敏感性与患者新辅助治疗疗效高度匹配，准确性为84%［18］。Emile Voest团队的研究建立了35例转移性结直肠癌类器官（组织来源于前瞻性临床研究TUMOROID），并且发现肠癌类器官水平的伊立替康单药或者联合5-FU的敏感性与患者疗效匹配，但类器官对氟尿嘧啶类药物联合奥沙利铂治疗的敏感性与患者临床疗效不匹配［16］。彭俊杰和华国强团队建立了转移性肠癌原发灶及肝转移灶类器官生物库（n＝50）并进行药物敏感性测试，结果显示同一患者肠癌类器官及肝转移灶类器官对FOLFOX及FOLFIRI化疗敏感性一致，并且类器官敏感性与患者临床疗效高度相关［49］。
除了上述肿瘤类器官敏感性预测患者疗效的回顾性研究以外，肠癌类器官也被用于前瞻性指导患者治疗方案的选择。Emile Voest团队的SENSOR研究是一项单臂、单中心、前瞻性临床试验，研究目的是评估在转移性结直肠癌患者中根据其肿瘤类器官药物敏感性来前瞻性指导患者靶向药物治疗选择的可行性［50］。主要研究终点为客观反应率≥20%。研究最终共纳入16例患者，其肿瘤类器官在培养成功后接受一组靶向药物包括vistusertib、capivasertib、司美替尼、吉非替尼、哌柏西利、阿昔替尼、gedatolisib、格拉吉布等处理后，对应患者根据筛选到的敏感药物接受相应药物的治疗。最终共有6例患者根据类器官药物敏感性接受了相应治疗，其中3例患者接受了vistusertib治疗，3例患者接受了capivasertib治疗，但相应患者在临床上并未表现出对治疗药物的敏感性。
2.胃癌类器官进展
胃癌是全球发病率第6和病死率第4的恶性肿瘤。目前，已证实可以通过手术切除标本、组织活检标本等途径获取胃癌组织并构建人胃癌类器官［12］。胃癌类器官建立的大致流程与肠癌类器官及成体干细胞来源的胃类器官相类似。肿瘤组织清洗、切碎并用消化酶消化。消化清洗后得到的细胞团块与基质胶混合并种植于孔板内，并加入含有多种生长因子的适合培养基进行培养。胃癌类器官的基础培养基由Advanced DMEM/F12、HEPES、Gluta MAX、青链霉素等组成［51］，此外，还需添加Wnt3a、Noggin、R-spondin、FGF10、胃泌素等对胃上皮细胞增殖分化较为重要的细胞因子，以促进干细胞干性的维持以及类器官的生长［52］。
胃癌类器官培养过程中需要应对的难点之一是正常胃上皮组织对胃癌类器官生长的影响。在培养过程中非肿瘤来源的类器官常常会过度生长，影响胃癌类器官的生长环境。这个现象的具体成因尚不明确，可能与肿瘤细胞更高的有丝分裂失败率所导致的细胞死亡有关［53］。解决这一问题的方法有如下几种：首先是根据肿瘤细胞的不同突变通过调整培养基成分对肿瘤类器官进行筛选。如许多胃癌存在P53通路的突变，这一突变特征可以通过加入MDM2抑制剂Nutlin-3进行筛选［54］；培养基中去除ROCK抑制剂Y-27632可以富集RHO失调的类器官［55］；对于存在EGF受体通路突变的肿瘤去除EGF或EGF受体抑制剂也可以去除非肿瘤成分。此外，部分胃癌类器官与正常胃上皮类器官形态差异较大，可以通过人工挑选的方式进行去除。在类器官培养之前预先对组织消化的细胞进行流式细胞分选，分选后的肿瘤单细胞再进行类器官的培养也是一种类器官构建方法。但上述方法均会丧失部分肿瘤组织的异质性［54］。
胃癌类器官在研究肿瘤的发生、抗肿瘤药物筛选以及患者个性化治疗等多方面被广泛应用。Helen Yan团队建立了来自34例患者的胃癌原发灶及淋巴结转移灶的胃癌类器官生物样本库，该样本库包含不同分期胃癌以及几乎所有的胃癌分子亚型。研究者利用该类器官库对37种抗癌药物进行了敏感性测试，其中VE822等药物在类器官中的作用效果与患者临床中的实际效果相同，说明临床前基于类器官的研究有可能有助于患者临床治疗选择［12］。Nina Steele等人优化了胃癌类器官培养和药物筛选体系，在患者手术后5～6天内即可根据类器官对药物的不同反应获得个性化的治疗建议［56］。
3.食管癌类器官进展(https://www.daowen.com)
食管癌是全球发病率第10和病死率第6的恶性肿瘤。根据组织病理类型的不同。食管癌可分为食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EADC）和食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）两类。目前ESCC类器官已经成功建立，Takashi Kijima等利用ESCC活检标本建立了可以长期培养的患者来源的ESCC肿瘤类器官，此类器官与ESCC组织具有相似的突变情况，并保留了较高的细胞功能异质性［57］。该模型可进一步被用于探索食管癌的耐药机制。迄今为止，有关EADC类器官构建的研究仍然较少，Xiaodun Li等构建了EADC类器官并证明该类器官与原有肿瘤组织具有相似的形态、转录组和基因组特征［58］。
巴雷特食管（Barrett食管）是EADC的一种癌前病变，构建合适的巴雷特食管癌研究模型对于探索EADC的发生发展有着重要的作用。2011年，Toshiro Sato等人利用肠道类器官培养基建立了巴雷特食管的培养体系，但此体系无法实现巴雷特食管的长期培养［5］。Xi Liu等人建立了巴雷特食管的长期培养体系［59］，在此体系中，原有肠道培养基中商品化WNT3a和R-spondin-1被50% WNT3a条件培养基和20%R-spondin-1培养基替代，并加入了PEG2。此体系中巴雷特食管类器官不仅能长期生长，还能较好地还原巴雷特食管的组织病理学特征。此外，对该类器官中的APC基因进行敲除后发现类器官出现多种食管癌特征，证明了此模型在研究食管癌发生发展中的可用性。
4.胰腺癌类器官进展
胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其中胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）占据了胰腺恶性肿瘤的90%，且5年生存率仅有10%～20%。为了研究PDAC的发病机制，2015年，Sylvia Boj团队首次用人PDAC样本建立了PDAC类器官的长期培养体系［60］，该体系体外培养的类器官仅表达导管上皮细胞的标志物，但并未表达其他两种细胞类型的标志物。将类器官种植于免疫缺陷的小鼠中则表现出胰腺上皮内瘤变样病变并进一步发展成浸润性肿瘤，证明胰腺癌类器官能够模拟肿瘤发生发展。高栋团队建立了84例患者来源胰腺癌类器官系，并进行转座酶可及染色质测序分析（assay of transposase accessible chromatin sequencing，ATAC-seq）测序及全基因组测序、转录组测序组学分析以及283种表观遗传相关药物和5种化疗药物敏感性分析，发现了具有潜在癌症驱动因素的调控性非编码突变，并揭示了药物敏感性相关的染色质可及性特征［26］。
除了使用胰腺癌组织进行类器官培养，还可以通过对正常胰腺组织类器官进行基因编辑来使其获得胰腺癌相关表型特征。2017年，Jonghyeob Lee等人在人类胰腺类器官中对PDAC的4个驱动基因KRAS，CDK N2A，TP53和SMAD4进行了过表达并利用此模型模拟PDAC的肿瘤形成过程［61］。利用类似的方法，Takashi Seino等人也通过CRISPR-Cas9技术对胰腺类器官中的PDAC驱动基因进行了敲除，并利用此模型在免疫缺陷的小鼠体内还原了从胰腺上皮内瘤变到腺癌的发展过程［40］。
5.肝癌类器官进展
肝癌是常见的消化道肿瘤之一，在世界范围内发病率占恶性肿瘤第7位且病死率居第3位；在中国发病率居恶性肿瘤第3位，给我国医疗系统带来巨大负担。
肝癌主要是由肝细胞癌和胆管细胞癌组成。肝癌类器官可由正常肝脏类器官经过化学处理或基因编辑后转化为肝癌类器官，也可由患者来源肝癌组织经过体外培养形成。患者来源的肝癌类器官一般有两个主要来源：肝癌穿刺活检样本和肝癌手术样本。肝癌类器官培养成功率较低，手术肿瘤样本提取成功率为37.5%，活检标本提取成功率为26%。目前为了分离肝癌类器官与正常肝类器官，可在基础培养基中添加Y-27632和地塞米松，去掉R-spondin、Noggin和WNT3a等因子［62］。Meritxell Huch团队成功培养出8例肝癌类器官，并证明了肝癌类器官与原发肿瘤的基因组改变、分子特征和转录组特征与原位肿瘤相似，并且建立了类器官移植瘤模型［62］。Markus Heim团队从肿瘤活检标本中建立10例肝癌类器官，并证明肝癌类器官能保持原位肝癌的形态及肿瘤标志物的表达并保留肝癌的遗传异质性，可用于测试对索拉非尼的敏感性［63］。此外，惠利健团队发现在人诱导肝细胞（human induced hepatocyte-like cell，hi Hep）中过表达c-Myc基因能够模拟肝癌的发生，并且该模型可用于探索肝癌潜在的预防方法［64］。
肝脏类器官已被广泛用于原发性肝癌的发生机制研究、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染模型建立及HBV感染相关研究中。肝癌类器官主要应用于肝癌患者的疗效预测、个体化治疗以及耐药机制的探索。一项研究表明PRMT6分子的过表达能够在肝癌类器官中减弱肿瘤的迁移和侵袭能力；而在正常肝类器官中用CRISPR-Cas9敲除PRMT6后对化疗和靶向药物的耐药性显著增加［65］。众所周知，HBV感染是原发性肝癌的危险因素之一。一项研究使用人类诱导多能干细胞建立了一种继承供体遗传背景的功能性肝类器官，并评估其在HBV感染模型建立和探索病毒-宿主相互作用中的应用，为研究HBV在肝纤维化和肝癌的发生机制中的作用奠定了基础［66］。
6.其他消化道肿瘤类器官进展
除了常见的消化道肿瘤，多项罕见消化道肿瘤类器官库也相继被建立。2019年，Aleksander Skardal团队建立了阑尾癌类器官库（n＝9），其类器官培养成功率约75%，研究证明来自不同患者的类器官对化疗反应不同，阑尾癌类器官是进行阑尾癌个体化药物筛选的良好模型［67］。此外，Jing Fu团队建立了患者来源的胆囊癌类器官模型（n＝5），并详细描述胆囊癌类器官保持了原位组织的组织病理学、遗传和转录特征以及肿瘤内异质性［68］。Hidetsugu Saito团队建立了包括肝内胆管癌、胆囊癌和法特壶腹神经内分泌癌在内的胆管癌类器官库（n＝6），并描述了类器官与原位组织的组织病理学、基因表达的相似性［69］。此外，该研究发现了胆管癌中SOX2可能是一个潜在的预后生物标志物［69］。2020年，Toshiro Sato团队建立了胃肠道胰腺内分泌肿瘤类器官库（n＝25），并且通过多组学测序（全基因组、转录组和转座酶可及染色质测序分析测序）全面描述了内分泌肿瘤类器官特性，其中，全基因组测序揭示了胃肠道胰腺内分泌肿瘤中TP53和RB1的频繁遗传改变，以及其特征性的全染色体杂合性丢失。转录组分析确定了通过不同转录因子的表达来区分的胃肠道胰腺内分泌肿瘤分子亚型［21］。