小鼠胚胎生物检测
小鼠胚胎生物检测,又称体外鼠胚实验,是验证辅助生殖实验室功能的良好检测方式。体外鼠胚实验的优点在于在小鼠胚胎培养的过程中需要实验室人员、环境、流程、设备、试剂、耗材的全方位参与,可以综合验证所纳入实验范围的所有参数。当最终结果达到预期结果时,可认为纳入考量的所有变量均处于正常运行状态,可批量验证人员、环境、流程、设备、试剂、耗材的可靠性。根据中华人民共和国医药行业标准YY/T 1434-2016《人类体外辅助生殖技术用医疗器械体外鼠胚试验》相关实验标准及方法,为尽量模拟辅助生殖实验室在正常运行下对人类胚胎进行操作的方式,将实验方法改进如下:
1.小鼠胚胎生物检测实验方法:
(1)实验动物:KM小鼠(或其他品系)。
(2)实验试剂:孕马血清促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、洗精受精液、箱外操作液、卵裂胚培养液、囊胚培养液、辅助生殖用油、生理盐水、透明质酸酶、75%酒精。
(3)实验器械及耗材:鼠笼、1mL注射器、眼科镊、解剖剪、手术器械盒、纱布、酒精棉球、滤纸、35mm组织培养皿、中央井培养皿、60mm胚胎培养皿、15mL离心管、巴斯德吸管、洗耳球、长镊子、酒精灯、剥卵针、移液枪、配套枪头、体式显微镜、倒置显微镜、恒温培养箱。
(4)操作步骤:
①第1天:供卵鼠注射PMSG,相当于人类进行超促排卵治疗方案的实施,日注射量10IU/只,1mL注射器小鼠腹腔注射0.1mL已经稀释好的PMSG溶液。
②第3天(扳机日Day 1):促排48h后注射hCG,相当于人类的扳机日,这一操作无须考虑动物房的光周期。应根据采卵时间来安排注射时间,最好在注射hCG后13～14h进行授精(如第一天晚上8点注射hCG,则应在第二天上午9点进行授精)。
a.在授精的前一天下午准备受精液和培养皿。
(a)新鲜精子皿:中央井培养皿,中央孔加200μL洗精授精液,盖油,37℃,通气平衡过夜。
(b)授精皿:中央井培养皿,中央孔加200μL洗精授精液,盖油,外周槽加2mL洗精授精液,不盖油,用于洗卵,37℃,通气平衡过夜。
(c)预热箱外操作液3mL,37℃,不通气,不盖油。
b.在PMSG注射48h后给供卵鼠注射hCG,注射量10IU/只,1mL注射器小鼠腹腔注射0.1mL已经稀释好的PMSG溶液。
③第4天(取卵日Day 0):
a.取精:用断颈法处死雄鼠,迅速分离出附睾尾和输精管,尽可能去除脂肪和血管,将它们放在过火的滤纸上,用解剖剪将附睾尾剪开并用镊子轻轻从输精管中挤出精子,挑取精液放于新鲜精子皿中。
b.轻轻地晃动培养皿30s使精子浮游(也可省略这一步),将培养皿放入培养箱中静置1h使精子获能。将精子悬液整倍稀释,观察精子的活力并用血细胞计数板测定精子的浓度,受精时精子的终浓度应为(1～2.5)×106个/ml。
c.评价精子的浓度与活力。
d.雌鼠注射hCG 12～13h后处死雌鼠。(https://www.daowen.com)
e.制备卵子采集皿:在35mm培养皿中加入2.5mL预热的箱外操作液,并贴上实验信息标签。
f.取卵:迅速剥离出输卵管并放入中卵子采集皿中,使用两个尖头镊子,双手配合在体式显微镜下将壶腹部撕破使卵丘团流出,用未拉制的巴斯德吸管将卵丘团放入受精皿的外周槽液滴中,轻轻吹打2～3次,将全部卵丘团移入受精皿中央滴中,放入培养箱孵育0.5～1h。
g.受精:将计算好的适量精液加入受精皿中央滴远离卵丘团的一端,随后将受精皿放入37℃,6%CO2,5%O2空气的低氧环境培养箱中静置4～6h,记录加精时间。
h.备卵裂培养皿:先在60mm培养皿底进行标号,每个皿可制备20个左右的小滴,然后在60mm培养皿上1/4处加入500μL卵裂胚培养液,再从这500μL卵裂胚培养液的大滴中分别取20μL在标号处制成小滴,盖油4ml,放入37℃、6%CO2培养箱通气平衡。
i.剥卵:4～6h后将受精皿从培养箱中取出,用剥卵针或拉制的巴斯德吸管轻轻吹打卵丘团,帮助颗粒细胞脱落,观察受精的卵子中两个原核存在与否以及第二极体是否排放。如无法完成剥卵方可使用透酶消化处理,并控制在30s以内,如实记录处理方式。
j.换液:将全部受精卵移入卵裂培养皿的大滴中,轻轻吹打2～3次,再将每个受精卵分别移入小滴中,每个小滴放1～2个受精卵。放入培养箱通气培养。
④第5天(Day 1):早晨检查2-细胞胚胎数量。在记录表中进行逐个评价和数量统计,未达到2-细胞的卵子应在胚胎培养表中记录其原核是否仍然存在并记录。
⑤第6天(Day 2):
a.下午观察6～8细胞,即观察胚胎是否发育至6～8细胞状态。
b.制备囊胚培养皿:根据胚胎发育情况,决定采用60mm或35mm培养皿制备,使用囊胚培养液,制备方法同卵裂培养皿。
⑥第7天(Day 3,移植日):
换液:将全部受精卵移入囊胚培养皿的大滴中,轻轻吹打2～3次,再将每个受精卵分别移入小滴中,每个小滴放1～2个受精卵。放入培养箱通气培养。
⑦第8天(Day 4):观察囊胚,统计囊胚形成情况。
2.小鼠胚胎生物检测结果的判读:如果有75%～80%以上的2-细胞胚胎能够发育到囊胚期或孵化囊胚阶段,表明测试的项目合格;表示本次所验证的所有变量均处于正常运行状态,可视为实验室处于良好的运行状态,适宜开展人类辅助生殖的相关实验。
3.小鼠胚胎生物检测的其他应用:
在实际工作中当鼠胚发育至6～8细胞胚胎或囊胚时也可以验证胚胎冷冻解冻技术,操作方式应完全参照人类胚胎的冷冻解冻方法和评价标准,这样针对各种技术的验证结果才有参考价值。
以上体外鼠胚实验不但可以验证实验材料与环境的可靠性,也可以用来培训新招聘人员,利用鼠胚对新招聘人员进行选卵、授精、胚胎培养、胚胎观察、胚胎冷冻解冻等技术及实验室基本技能培训。通过动物实验考核后的人员方能证明其掌握了胚胎培养的临床操作技能。当体外鼠胚实验用于新人考核时培训的全过程应有完整的文字记录。
