分子病理学在脊柱转移癌中的应用
随着分子生物学技术的发展，病理学视野极大扩展，分子病理学不仅在传统诊断和鉴别诊断中起了十分重要的作用，在指导临床制定治疗策略和预测肿瘤生物学行为等方面也发挥着重要的角色。常用的针对蛋白质的技术有组织芯片、流式细胞术；针对DNA和RNA的有荧光原位杂交、显色原位杂交、PCR和测序［60］。分子病理学根据用途可分为分子诊断和分子治疗。脊柱转移癌依靠组织病理学和免疫组织化学就能明确诊断，故分子病理主要用于指导靶向药物选择，特别是在原发灶无法获取基因检测样本的情况下，转移灶的基因分型尤为有用。
（一）荧光原位杂交（FISH）
应用荧光素标记的DNA特定探针与组织切片中的肿瘤组织杂交，在荧光显微镜下观察染色体易位、缺失和基因扩增。此法可用于新鲜组织，也可用于石蜡包埋切片，其优点为只需要很少的肿瘤组织即可进行检测，因此对于活检取样量少的组织尤为适宜。FISH最常用的探针是α-卫星DNA探针和位点特异性（或基因特异性）DNA探针。在实际工作中所使用的探针绝大多数均为断裂—分离探针，检测某种基因是否有易位或重排，但不能判定其伴侣基因。理想情况下采用融合探针可以帮助确定具体的基因融合类型，但一些肿瘤拥有多个伴侣基因，部分伴侣基因发生频率低，如均采用融合探针检测则成本高，并不适合常规开展。其他多色FISH检测如光谱核型分析（SKY）、多色FISH（M-FISH）和复合二重比FISH（COBRA-FISH）等，采用不同颜色的荧光染色，标记全部染色体，可在一个杂交实验中展现整个染色体组的复杂重组［61］。这些检测方法主要应用于研究性工作。在脊柱转移癌中，FISH检测的临床应用主要有以下两个方面：
1.检测肿瘤的基因扩增，如乳腺癌、胃癌的HER-2/neu基因检测。HER-2作为曲妥珠单抗的生物标志物，是临床靶向治疗必须的检测项目。以乳腺癌HER-2检测为例，HER-2/CEP17比值小于2.0时，FISH结果阴性；HER-2/CEP17比值大于或等于2.0时，有时可呈现红色信号凝块状，FISH结果阳性（图2-27）。
图2-27 浸润性乳腺癌HER-2双探针荧光原位杂交（FISH）检测结果。A.FISH阴性B.FISH阳性
2.检测基因易位，如肺癌ALK和ROS1检测。断裂—分离探针根据基因断裂点两侧端粒带和着丝粒设计探针，杂交后分别显示红色和绿色。正常情况下，两种颜色的探针信号叠加呈黄色，基因易位后，可显示两个分离的红色和绿色信号（图2-28）。
图2-28 肺腺癌ALK荧光原位杂交（FISH）检测结果；A.未检测到ALK易位B.检测到ALK易位
（二）PCR法
在转移癌中应用最普遍的是实时荧光定量PCR和RT-PCR，可与FISH配伍，主要用于确定融合基因的具体类型，并可通过DNA测序确定具体的融合位点。转移性肺腺癌中用ARMS法检测EGFR第18、19、20、21号外显子的缺失、插入或突变情况（图2-29），检测结直肠癌的K-ras、BRAF等；除FISH外，RT-PCR也可以用于肺腺癌的ALK和ROS1的检测。(https://www.daowen.com)
图2-29 肺腺癌ARMS法EGFR基因突变检测图
（三）测序法
测序分析样本可采用石蜡包埋样本、新鲜组织、各种体液上清液等，基于高通量测序技术，临床可获取更全面的检测数据。目前一代测序法临床应用广泛，如胃肠间质瘤中检测C-kit基因第9、11、13、17号外显子和PDGFR基因第12、18号外显子突变（图2-30）。但骨转移癌患者通过肿瘤组织检测驱动基因突变状态有许多局限性，如标本不易获得、样本量不足等，二代测序（NGS）技术弥补了这些缺陷，它可以同时检测多个基因，能更好地指导靶向治疗。
图2-30 胃肠间质瘤测序法C-kit基因突变检测图
（四）其他分子检测技术
显色原位杂交（CISH）可替代FISH法来检测某些基因改变，但CISH方法中可被光学显微镜分辨的颜色种类非常有限，CISH应用侧重于检测数量的变化（例如非整倍体和扩增）。传统的比较基因组杂交技术（CGH）和阵列CGH主要用于检测基因获得或缺失变化，不能检测到平衡染色体易位，主要应用于研究性工作。
新的分子技术还包括单核苷酸多态性阵列、基因表达微阵列分析、RNAseq、基于锚定多重PCR的靶向NGS和基于荧光的NanoStringn Counter等，有助于发现肿瘤中新的基因异常，对分子诊断和潜在的靶向治疗具有重要的价值，有条件的单位应积极开展。
（韩磊，李鹍，张娅，叶丽娟）