肝癌细胞模型
新鲜分离的人原代肝细胞保持了原有的结构和大多数的体内功能，但丢失了特定的膜区域，如细胞间连接和胆管结构，而且细胞极性和功能会迅速消失，若悬浮培养仅能存活4~6小时。同时，由于人原代肝细胞存在价格昂贵、无法增殖、批次间差异大等诸多不足，临床通常采用高通量人源化肝细胞筛选模型进行研究。用于药物筛选及生物学机制研究的肝细胞模型应具备与体内肝细胞相近的结构与功能，如细胞的极化、关键代谢酶的水平和转运体的表达等，同时，也应有一定的功能稳定性和较长的使用寿命，以进行长时间的实验。目前使用较多的肝癌细胞系包括HepG2、Hep3B、Huh-7、Fa2N4和HepaRG等。
一、肝癌细胞系
1.HepG2细胞系 HepG2细胞来源于人类肝母细胞瘤，其所含的生物转化代谢酶与人正常肝实质细胞具有同源性。虽然HepG2细胞是1种肿瘤细胞，但是它的分化程度较高，并且保留了较完整的生物转化代谢酶，因此，用HepG2细胞做遗传毒性实验不需加入外源性活化系统。人原代肝实质细胞经分离后，只能经历有限的几次分裂，其内在的代谢酶很快失去活性，而HepG2细胞作为分化好的细胞系，其内在的药物代谢酶活性稳定，不会随着传代次数的增多而降低。以上2点使得HepG2细胞较其他的外来化合物遗传毒性检测系统更具优势。
HepG2细胞内保留了多种细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）同工酶，不同的同工酶负责激活不同的前致突变物，所以，HepG2细胞可广泛应用于各种可疑致突变物的快速筛检，其中，CYP 1A主要针对多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbon，PAH）类及芳香胺类，CYP 3A对硝基芘类及黄曲霉毒素类具有较强特异性，CYP 2B可以激活多种结构互不相关的化合物。除了CYP同工酶，HepG2细胞内还保留了其他氧化还原酶，参与电子传递及活性氧的生成和清除。
需要特别指出的是，HepG2细胞内的CYP 1A2和CYP 2E1的含量很少或检测不到。CYP 1A2对活化芳香胺起着重要的作用，但是即使没有CYP 1A2，芳香胺依然对HepG2细胞表现出明显的遗传毒性，这可能是因为HepG2细胞内CYP 1A1含量丰富，芳香胺可以被CYP 1A1活化。CYP 2E1在活化亚硝胺的过程中起着至关重要的作用，大多数亚硝胺类物质对HepG2细胞仅表现出轻微或不具有遗传毒性，可能和HepG2细胞内CYP 2E1的缺失有关。
应用HepG2细胞遗传毒性检测外源性化合物的毒性，主要可检测霉菌毒素类，如黄曲霉毒素B1、啮齿动物致癌物赭曲霉毒素A和伏马菌素B1；亚硝胺类，如1-亚硝胺、吡咯烷亚硝胺；芳香胺类和杂环芳香胺类，如联苯胺、2-氨基-3-甲基-咪唑并喹啉；某些具有生物活性的天然植物成分。还可应用HepG2细胞检测一些天然植物成分的抗突变效应，如十字花科蔬菜中硫甙的水解产物异硫氰酸酯及黄酮类化合物白杨素。
2.Huh-7细胞系 Huh-7细胞由Nakabayshi和Sato建系，来源于1位57岁日本男性高分化肝细胞癌患者，细胞中不包含乙型肝炎病毒（HBV）的DNA，但能被HBV转染。Huh-7细胞与HepG2细胞一样均为来源于人的肝癌细胞系，若HBV的DNA被转入Huh-7细胞系中，该细胞系可被检测到HBsAg、HBeAg、HBcAg蛋白。Huh-7细胞与HepG2细胞的区别在于Huh-7细胞表面有CD81受体，因此，HCV能感染Huh-7细胞而不能感染HepG2细胞。Huh7细胞除了CYP 1A1和CYP 3A4表达量稍高，其他CYP酶表达水平均很低。目前，Huh-7细胞系主要被用来进行体外培养感染肝炎病毒的模型，确定肝炎病毒中各蛋白的功能区、感染肝炎病毒后细胞体内变化所依赖的信号通路，明确体外表达肝炎病毒中的各种蛋白，并研究其功能。
3.HepaRG细胞系 HepaRG细胞是Gripon等从慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC）导致的肝癌患者体内分离，加入二甲基亚砜（dimethyl Sulfoxide，DMSO）、氢化可的松、胰岛素诱导分化而成。培养基上清可被检测到HBV抗原和HBV的DNA。HepaRG细胞具有肝细胞的大多数生理功能，包括药物代谢所涉及的主要CYP酶系，既可用于转染，又与原代肝细胞一样适合含HBV血清直接感染。HepaRG细胞是肝前体细胞系的终端分化肝细胞，具有分化成肝样细胞和胆管样细胞的潜力。与其他肝癌细胞系相比，HepaRG细胞可表达多种CYP酶（CYP 1A2、CYP 2B6、CYP 2C9、CYP 3A4）和Ⅱ相代谢酶。CYP酶的表达水平与人原代肝细胞相近，可被特异性的诱导剂诱导，而且其代谢能力可以维持数周，为长期重复给药评估慢性毒性提供了可能。因此，HepaRG细胞可被用于检测活性代谢物导致的肝毒性。同时，HepaRG细胞也表达多种转运体，可被用于评估药物对转运体正常功能的影响。
HepaRG细胞的培养需要高浓度的DMSO以维持细胞的分化状态并诱导CYP酶的表达，而DMSO对肝细胞具有潜在的毒性，因此，HepaRG细胞可能会影响待测化合物的毒性检测结果，导致假阳性。另一方面，虽然HepaRG细胞表现出较强的代谢活性，但仍有一些代谢酶的表达水平较低，如CYP 2D6和CYP 2E1。为了使其进一步接近人肝细胞的代谢能力，研究人员将低表达的基因转染至HepaRG细胞中，利用该方法已得到可以短暂高表达CYP 2E1的HepaRG细胞。但不足之处在于，细胞最多只能被转入2种酶的基因，且表达水平经常不稳定，通常过高或过低。
4.乙型肝炎病毒感染模型 常用的可转染HBV的肝癌细胞系主要有PLC/PRF/5细胞系、Hep3B细胞系和HepG2细胞系等，上述细胞系近似高分化的正常肝细胞，具有绝大部分肝细胞的特异功能特性。用HBV阳性血清感染HepG2细胞建立1种体外稳定表达HBV的细胞培养体系——HepG2-HBV细胞，该细胞可表达HBsAg、Pre-S1、Pre-S2和HBeAg，并能被检测到HBV的DNA复制中间体和转录体。HepG2-HBV细胞能模拟自然状态下的HBV持续感染的过程。利用HBeAg阳性患者血清纯化所得的HBV颗粒直接感染HepG2细胞35天后，存活下来的细胞可被检测到HBV的DNA和表达蛋白。该细胞模型适用于对HBV的DNA结构和功能，HBV的吸附、侵入和脱壳过程，以及抗病毒药物的研究。
PLC/PRF/5细胞是在自然状态下被HBV感染的人肝癌细胞。Alexander等从1例HBsAg阳性的男性原发性肝癌患者中分离出1株人肝癌细胞系，代号为PLC/PRF/5。该细胞形态为上皮样细胞，每35~40小时分裂1次，无接触抑制。PLC/PRF/5细胞整合有HBV的DNA，能持续产生HBsAg、α1抗胰蛋白酶、铁传递蛋白、α2巨球蛋白、补体C3、癌胚抗原及甲胎蛋白等7种人血浆蛋白，但不产生HBcAg、HBeAg和HBV感染颗粒，其分泌的HBsAg与血清来源的HBsAg具有相同的多肽。与其他HBV细胞模型相比，PLC/PRF/5细胞具有HBsAg分泌稳定、量多、持续时间长的特点，适用于筛选抗HBV药物和观察药物对该细胞系HBsAg表达和分泌的影响，是研究慢性HBV感染的安全体外模型。
5.丙型肝炎病毒感染模型 自1989年鉴定出HCV以来，人们就一直试图建立HCV体内外模型，以方便对HCV的致病机制、生命周期等方面进行全面研究。含HCV的血清感染人淋巴细胞系、人胆上皮细胞、原代肝细胞（来源于人、黑猩猩或树枸）曾被用来建立细胞模型。尽管原代肝细胞能被HCV成功感染，但HCV复制水平低，研究人员只能凭借RT-PCR技术检测到病毒，加上原代肝细胞和病毒血清的质量难以控制，这些不足都限制了细胞模型的应用。
在选择性双顺反子亚基因组HCV的RNA复制子系统的基础上，科学家们建立了一种新型的瞬时表达复制子系统，即用报告基因取代传统复制子结构中的NEO筛选基因，通过检测报告基因的表达活性分析病毒复制，简化了研究。(https://www.daowen.com)
直至2005年，HCV细胞感染模型研究才取得突破性的进展。研究人员从1名患有爆发性肝炎的日本患者身上分离得到1株HCV病毒株，命名为JFH1，用其全基因组转录其RNA体外转染Huh-7细胞，转染24小时后，Northern印迹检测到HCV RNA，并在72小时后仍为阳性结果；免疫荧光检测显示，转染后72小时，70％~80％的细胞表达核心蛋白和NS3蛋白。该细胞模型能稳定地支持HCV的RNA复制，在转染5天后，检测发现HCV的RNA和蛋白表达达到高峰，并在接下来的7天中维持在高水平，稍后出现轻微下降。以E2特异性抗体对转染后的Huh-7细胞进行免疫电镜检测，结果亦呈阳性。以转染过JFH1的Huh-7细胞培养上清液孵育未转染的Huh-7细胞48小时，核心蛋白和NS5A蛋白呈双阳性。病毒颗粒浓度是1.15~1.17g/mL，直径55 nm，外形呈椭圆形。在抗体中和试验中，以CD81抗体孵育Huh-7细胞，与对照组相比，90％细胞的HCV感染效率受到抑制。感染HCV的患者血清也可以抑制该病毒再次感染Huh-7细胞。将转染JFH1的Huh-7细胞培养上清液稀释至10000倍后取1mL静脉注射给黑猩猩，6周内没有感染迹象；再取1mL稀释至1000倍后再次注射，2周后检测到HCV的RNA表达，且持续到第5周。
二、永生化原代肝细胞
由于肝癌细胞系和人原代肝细胞在部分功能上还存在较大差异，人们尝试在人原代肝细胞中过表达病毒致癌基因和（或）人端粒酶逆转录蛋白（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）基因，使其永生化。将病毒的致癌基因，如猿猴空泡病毒40大T抗原（simian vacuolating virus 40 large T antigen，SV40 TAg），转染至啮齿动物的肝细胞可以使其永生化，但是在人肝细胞中过表达这些致癌基因却只能延长肝细胞寿命，并且会出现染色体畸形。与过表达病毒致癌基因相比，过表达hTERT基因出现基因和表型不稳定的情况较少，但是这种方法只适用于部分人肝细胞类型，包括胚胎肝细胞和新生肝细胞。与成体肝细胞不同，这些未成熟的肝细胞在体外本身就具有自我增殖能力，但随着复制的进行，端粒逐渐缩短，会出现增殖老化。因此，过表达hTERT基因就可以使其永生化。然而，对于在人成体肝细胞中过表达hTERT基因，不同实验得出了相反的结果。用他莫昔芬介导的Cre-loxP系统在人成体肝细胞中高表达hTERT基因，得到了1种可逆的永生化原代肝细胞系16T-3。而用慢病毒转染的方式向人成体肝细胞中导入hTERT基因却不能延长细胞寿命，这可能是由于过表达hTERT基因不足以驱动细胞进入细胞循环。特定的永生化基因组合，如SV40 TAg、hTERT和B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点-1类似物（B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site-1，Bmi-1）过表达，可以使成熟的人肝细胞永生化。通过这种方法得到的永生化肝细胞不具有致瘤性，但同时也丢失了许多肝细胞的特异功能。
肝细胞的增殖和分化是相互独立的。因此，人们采用条件性永生化的方法控制细胞系的增殖，从而使肝细胞可以更好地分化。常用的条件性永生化方法有温度调节、重组调节和转录调节。温度调节依赖于1种温度敏感的SV40 TAg变异体。这种变异体只在33℃时表达并活化，使肝细胞进行增殖，在37~39℃时就会失活，停止细胞循环。重组调节使用位点特异性重组系统，如Cre-loxP和FLP-FRT系统，进行可逆的永生化。转录调节通过控制永生化基因的转录水平，实现肝细胞增殖的重复循环和生长停滞，进行可逆的永生化，由于这种方法不依赖于重组酶，因此不会出现染色体重排的情况。研究发现，移植条件性永生化大鼠原代肝细胞可以保护门腔静脉分流的大鼠不患高血氨诱导的肝性脑病，提高急性肝损伤大鼠的生存率，且通常不具有致瘤性。
三、细胞培养体系
当肝细胞所处微环境与体内环境越接近时，其形态和功能就能越好地维持。目前，改变培养体系的方式主要有2种：向细胞培养基中加入可溶性的促分化物质，改变培养方式来维持细胞间和细胞与基质间的相互作用。常用的可溶性促分化物质包括一些生理因子，如胰岛素、表皮生长因子、烟酰胺等，还有非生理添加物，如DMSO。常用的培养方式有悬浮培养、2D培养、三明治培养和3D培养。由于悬浮培养的细胞活性维持时间过短，因此使用较为局限，常用于代谢实验。
1.2D培养模型 将原代肝细胞接种在1层固相的细胞外基质上，如胶原、纤连蛋白或人工基底膜，进行单层培养，可以保留大多数肝的特异性功能，如糖的代谢和储存、尿素合成、血浆蛋白合成和分泌、脂质合成和转运、胆酸合成和吸收，以及药物代谢。但是一旦进行培养，肝细胞的形态、结构和极性就会发生显著改变。另外，随着培养时间的延长，肝细胞功能会急剧减弱，尤其是药物代谢能力。因此，2D培养仅适用于短期（1周内）的药物肝毒性研究。
2.三明治培养模型 为了使肝细胞在长期培养过程中保持肝的特异性功能，人们将原代肝细胞置于2层基质（下层为胶原，上层为人工基底膜）之间制成三明治培养模型。在该培养条件下，细胞保持一种与体内相似的多边形形态，细胞活力、药物代谢酶活性和尿素分泌能力均有所增强。更重要的是，三明治培养模型培养肝细胞可以形成极性的基底膜和类胆小管结构，分别介导细胞吸收和胆汁外排。许多药物抑制胆汁外排导致胆汁阻滞，而这正是药物性肝损害（DILI）的重要机制之一。因此，三明治培养模型是研究肝胆药物转运体功能及其调控的首选体外模型。尽管与原代肝细胞相比，三明治培养模型表现出诸多优势，但随着培养时间的延长，与肝细胞功能相关的基因表达也会逐渐减少，一般培养时间不宜超过2周。
3.3D培养模型 体内的肝细胞具有多边形的形态和多极化的膜，包括至少2个基底面和2个极化面。传统的2D培养无法在体外重现肝细胞的3D形态和结构，且细胞功能会迅速衰退，不能进行长期研究。因此，肝细胞的3D培养模型应运而生。原代肝细胞、肝细胞系和多能干细胞诱导分化肝细胞的3D培养模型均表现出优于2D单层培养的功能特性，尤其是代谢酶的表达。
4.多细胞培养模型 悬浮培养的肝细胞在不黏附基质的情况下会形成3D组织或多细胞球。肝细胞球中的肝细胞紧贴在一起，产生了自身的细胞外基质。因此，肝细胞球保持了多数的细胞间及细胞与基质间的连接，对维持细胞的分化和功能非常重要。据研究报道，多细胞培养模型（multicellular spheroids）具有长期的细胞活性，维持了肝细胞的极性，并有Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶的表达。因此，肝细胞球可应用于分析药物代谢物，研究药物的长期肝毒性。在培养方面，肝细胞球的大小是一个关键因素。如果肝细胞球直径大于200μm，氧气就无法渗透到内部，从而导致中心的细胞发生坏死。
5.共培养模型 肝脏是一种非均质的脏器，实质肝细胞占肝细胞总数的60%，另有肝上皮细胞、肝巨噬细胞（又称库普弗细胞，Kupffer’s cell，KC）、肝淋巴细胞、胆管细胞和星状细胞等非实质肝细胞，占肝细胞总数的40%。研究表明，药物不仅以实质肝细胞为攻击对象，还可以诱导非实质肝细胞损伤，从而加剧对实质肝细胞的破坏。另有研究发现，非实质肝细胞可以产生炎症因子、氧化应激、微小核糖核酸（microRNA），或直接与实质肝细胞作用，从而对多种肝病的发展起到促进作用。另一方面，多种细胞共同培养形成的微环境与体内情况更为相似，也更有利于肝细胞功能和活力的维持。所以，仅用实质肝细胞在体外研究肝毒性机制是不全面的，非实质肝细胞的作用也不容忽视。