肝癌动物模型
肝癌是由病毒、化学致癌物等诸多因素引起的肝细胞生长失控而导致的癌变，经历多个阶段的发病过程，与多种基因的调控和表达密切相关，但是肝癌的致病机制尚不清楚。同时，因为肝脏本身解剖结构的特点，治疗难度进一步增加。目前针对肝癌的治疗，早期建议手术治疗，小肝癌和晚期肝癌可以采取介入治疗及其他治疗。长期的循证医学发现，以上这些方法的疗效亦不确切，研究人员仍在探索更加有效的治疗方法。因此，建立接近人类肝癌临床特征的动物模型对研究肝癌与寻找新的治疗方法具有重要的现实意义。当前肝癌模型主要采用的动物包括小鼠、大鼠、裸鼠、仓鼠、兔、猪、鱼等，肿瘤的成因主要包括自发性、诱发性和移植性。
一、肝癌模型
1.移植瘤模型 动物移植瘤模型的建立方法就是将来源于人或动物的肝癌组织、细胞株移植于动物体内，经过一段时间培养后而形成的肝癌模型，目前最常用的移植部位是背侧皮下、肝脏或腹腔等，移植方式主要包括同种移植和异种移植。
（1）动物选择：小鼠、裸鼠和家兔主要采用移植瘤株构建模型。小鼠和裸鼠主要是异位移植，以腋窝和背部皮下为主，采用的瘤株多为小鼠肝癌H22细胞和人肝癌HepG2细胞。一般用来进行药物试验，特点是建模快捷、观察方便；家兔因为个体较其他模型偏大，容易通过外科手术直接将瘤株移植于肝脏，在进行放射性治疗和影像学研究方面更有优势，主要采用VX2瘤株；大鼠和斑马鱼主要用于肝癌病因学的研究，以化学物质诱发肝细胞癌，常用Wistar、SD大鼠研究致病机理，诱导剂一般采用二乙基亚硝胺（DEN）、黄曲霉毒素（AFB1）、四氯化碳（CCl4）、二甲基氨基偶氮苯（3’-Me-DAB）等，斑马鱼作为生物模型始于19世纪80年代，构建肝癌模型的优势在于其肝细胞功能接近哺乳动物，如肝脏发育的信号通路和相关因子、糖原和脂肪的储存、胆汁分泌、血清蛋白分泌等，并且与人类基因有87%的同源性。但与哺乳动物模型不同，斑马鱼难以开展移植性操作，多采用诱导性和转基因技术处理胚胎以得到目的模型。
（2）位点选择：移植性肿瘤模型位点从最初的皮下移植逐渐发展至腹腔移植、原位移植、血液移植、淋巴移植等。移植的类型主要包括同种移植和异种移植。目前有关肝癌动物模型的移植位点选择主要包括以下几种。
①皮下移植：皮下是各类模型最常用的移植位点，早期的移植材料来源为新鲜的人肝癌边缘组织，成功率较低，只有11%左右，后来逐渐发展为应用细胞株，在肝癌研究中，将人或动物的肝癌细胞株（或组织）移植于颈背部、腋下、后肢等部位的皮下，移植成功率分别为前肢腋下＞躯干近头侧＞背部＞后肢，其中，将人肝癌细胞移植到免疫功能缺陷小鼠的颈背部皮下，当移植的肿瘤细胞数为（1~5）×106时，成功率接近100%，由该癌株增殖的肿瘤基本具有人肝癌细胞的特性，所得实验结果更有意义。皮下移植不仅操作简单、观察测量方便，而且可以作为原位移植瘤的瘤源，但其缺点是缺乏肝癌细胞与肝脏组织的相互作用，在实验中有部分呈假阳性，研究肝癌的远端转移也较难得到理想模型。
②原位移植：原位移植较皮下移植有较高的操作要求，但其优点在于保留了原有肿瘤组织的生物学特点和微环境，能更好地反应肝癌的侵袭能力和免疫逃逸机制，腹腔浸润转移和腹水等生理现象也多见于此模型。原位移植模型的建立一般有2种途径，一种是将剪好的肿瘤组织（1mm×1mm×1mm）通过外科手术方法（开腹、穿刺）植入肝区，也有很多模型是通过辅助设备进行肝癌的移植，如经皮穿刺CT、DSA、MRI影像引导制作兔VX2肝癌模型；另一种是将细胞悬液直接注入肝左叶，在细胞数目为（1~5）×106时，较易发生远端转移。在先前的实验研究中，原位移植瘤的缺点在于只有将模型处死后才可进行瘤体组织的取出及测量；现在有了影像学设备的辅助，使在体观察肿瘤生长甚至新生血管变化成为可能。
③腹腔移植：腹腔移植在操作方面最为简单，并且可出现一定数量的转移、浸润、腹水的案例，但缺点在于不便于进行瘤体的观察和测量。移植方法是将人肝癌细胞株或组织碎片注入腹腔内，动物的前侧腹壁比后侧腹壁更有利于癌株的增殖。该模型的应用主要包括以下几点。a.研究肝癌侵袭周围组织和肺、肝、肾、肠等远端器官的转移过程。b.药物筛选试验。c.腹腔移植可以传代和培养，在进行原位或异位移植前，将复苏的瘤株注入目标动物腹腔内传代，待传代完成后可得到理想数量的肝癌细胞，并且传代后活性更高，对体内环境适应性更强，有利于提高移植成功率。
④静脉移植：中国肝癌患者的发病易伴发多种途径转移。肝癌细胞因自发或诊疗操作进入血液循环系统，称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC），随血液流动移植于某个器官便发生了肝癌的远处转移，返回肝脏组织后移植便是复发性肝癌。据报道，免疫疗法对肝癌复发或转移的患者行之有效，因此，研究人员需要通过多发转移性肝癌动物模型进行试验，CTC模型建立的主要方式是静脉移植，一般是将低剂量的肿瘤细胞注入门静脉或脾静脉，可研究肝癌的转移机制，探索更有效的治疗策略。
（3）移植模型制作
①肝内移植：目前常见的肝内移植建立方法是预先准备肿瘤组织块（约1.5mm3），用套管针在动物肝脏扎入约2.5mm深，将组织块移植在肝内，拔出套管针，然后用无菌干棉签按压止血或用医用止血贴止血，逐层关腹缝合皮肤。目前，大多数肝内移植建造肝癌模型的操作过程存在很多缺点，如肝脏大量出血、操作时间长、大批量建模时需要耗费大量的时间和精力等。因此，最近许多实验进行了改进，首先进行动物肿瘤细胞的皮下移植，成瘤后切除皮下移植瘤，然后切成碎片注射入肝脏。近年，有学者提出了具有较强创新性的夹心法，用手术线将肿瘤组织缝合，夹在肝右叶和肝左叶之间，大大缩短了手术时间，造模成功率达100%；还有学者选择将小鼠的肝脏挤出腹腔，注射肿瘤细胞后，用灼红的铁丝轻灼针眼，封闭针道，这种方法的成瘤率达95%；还有学者用可吸收性明胶海绵压迫切口，一方面可以有效止血，另一方面可以防止肿瘤细胞外漏形成腹腔转移，建模的成功率也达100%。考虑到外科手术创伤大，手术时间长和恢复差，导致术后动物模型的发病率和病死率增加，改进方法为超声引导下经皮植入肿瘤细胞建立兔肝肿瘤模型，这种方法大大降低了感染率和腹腔移植率，技术上成功率为100%，造模成功率达92%。此外，对注射肝叶的选择也是重要影响因素，肝左叶的建模成功率明显高于肝右叶。由于肝脏的解剖特点，肝脏左叶与周围组织的重叠较肝脏右叶少，不易与周围组织粘连，在后期验证实验结果更加方便，肿瘤细胞的生长更加局限，不易向周围组织侵犯，更有利于模型的建立及后续研究的进行，在实验过程中也可避免操作时右侧注射的肿瘤细胞形成腹壁转移，所以，选择肝左叶注射有利于建立肝癌动物模型。肝内原位移植方法的优点有两方面，一方面是肿瘤细胞生长在正常的肝脏内，与人类肝炎、肝硬化、肝癌的发展演变过程类似，另一方面，相较于异位移植瘤模型，这种模型的肝脏肿瘤在肝脏内生长，更能模拟肝内肿瘤的生长微环境，与人类肝癌的生长有密切的相关性，因此，它可以成为一个非常有用的肝癌研究模型。
②经门静脉移植：脾静脉注射肿瘤细胞属于经门静脉移植的一种方式，将脾脏从中间横断，操作时避免了损失脾脏两极的血管，然后从脾下极注入肿瘤细胞，同时夹闭脾上极血管，使肿瘤细胞经过脾静脉进入肝脏，这种实验的优势在于肝转移出现率达100%，同时该方法可以保留部分脾脏，并且可以重复操作。脾静脉注射需注意以下几点。肿瘤细胞悬浮液必须是单细胞悬浮液，因为聚集的肿瘤细胞可能阻塞门静脉导致小鼠术中死亡，所以制备肿瘤细胞悬浮液时应与磷酸盐缓冲液充分混匀；在肿瘤细胞注射过程中，应仔细观察脾被膜，防止肿瘤细胞被注入被膜内，在注射后应仔细观察脾脏的颜色加以区分；在松开夹闭的血管夹前应确认注射口有无出血，如果有出血，一般可以用无菌棉签压迫止血，必要时可以使用血管夹。通过脾静脉移植肿瘤细胞建立动物肝癌模型的优点是一定会出现肝脏肿瘤，在一定程度上模拟了肝癌的生长过程，但是仅限于小数量的建模，手术方法相对烦琐，大批量建立肝癌模型有一定的局限性，同时存在部分肝癌动物模型的肿瘤细胞随门静脉系统进入其他器官出现肝外转移。
选择性门静脉注射是近年来比较创新的另一种门静脉建模方法。首先将小鼠麻醉，之后开腹解剖肝脏门静脉，夹闭小鼠的肝左叶门静脉，然后从门静脉主干注射肿瘤细胞，完成后松开夹闭的肝左叶门静脉。此方法的优点为：限定了肿瘤细胞在小鼠特定肝叶的生长，肿瘤细胞没有出现肝外扩散，同时也保留肝功能，并使肝组织不受影响，造模成功率为100%；该方法可以在短时间内完成，同时保持了肿瘤模型的一致性、建模的可重复性、肝叶的可选择性，保留肝脏实质完整；与其他造模方法的时间相比，这种造模方法7天左右可以检测出肿瘤，可以使生物研究和临床前测试在很短的时间内完成，而化学因素诱导目前需要4周，基因修饰需要大约4个月，因此，这种建模方法对有时间限定的研究者来说是一种非常有效且实用的方法。
2.诱发性模型 诱发性肝癌模型是传统的建模方法，其原理是通过物理、化学、生物的致癌因素长时间作用于动物而形成肝癌，其中，以化学因素最为常用。
（1）亚硝胺类：在化学因素诱导肝癌动物模型的实验中，以二乙基亚硝胺诱发肝癌模型为最常见，最经典的是“饮水法”建立肝癌动物模型，形成肝癌模型的动物很多。目前，这种造模方法的技术非常成熟，其诱导的特点是成功率高，最高可达100%。二乙基亚硝胺对肝脏针对性强，肝细胞癌所占比例大，是迄今应用最广泛的一种诱发肝癌模型的化学性药物。在二乙基亚硝胺诱导肝癌动物模型中，整个肝脏经历肝损伤期—肝硬化期—肝癌期的变化，并在实验中充分得到验证，其病理过程分为3个阶段：早期（1~13周）表现为中毒性肝炎，中期（14~23周）为肝硬化期，晚期（24~44周）为癌变期。成功建模后的肿瘤兼具肝炎、肝硬化的背景，与人类肝癌形成过程十分类似，为肝癌的研究提供了很好的借鉴方法。但是，此类模型耗时长，动物死亡率高，同时，在长期的实验过程中，二乙基亚硝胺对实验者本身也存在伤害，所以这种方法有待改善。信波等摸索出一种更有效的方法，即在实验中适当加大二乙基亚硝胺的给药浓度，并辅助使用肿瘤促进剂四氯化碳及乙醇，使成模周期缩短至150天。与传统造模方法相比，该方法在一定程度上缩短了造模时间，且存活小鼠肝脏肿瘤成癌率达100%，获得了理想的肝癌动物模型，这种造模方法也可以大批量实施。由于该造模方法优点十分突出，以后的建模方法可以在此基础上进一步改进，缩短建模时间后更有利于研究肝癌的发病与治疗。
（2）黄曲霉毒素B1（AFB1）：肝毒性的AFB1主要是由曲霉属的某些真菌产生，如黄曲霉，具有致癌活性。目前研究发现AFB1致癌机制与诱导染色体畸变密切相关，均通过染色体链断裂、DNA复合物生成、微核控制DNA合成等一系列反应最终使细胞癌变。传统的造模方法是给7天龄小鼠注射6mg/kg的AFB1，持续注射52周后，研究者可以在小鼠肝脏发现肿瘤。在这种传统造模方法的基础上，研究者通过逐渐增加腹腔注射AFB1浓度的方法，最终在第45周的造模成功率达80%（20/25）；还有学者提出了一种新的改进方法：用DMSO溶解AFB1后，连续腹腔注射，最快可以4周建成肝癌模型，这种化学诱导方法使建模时间进一步缩短。研究者们在此实验基础上不断改进，有效缩短了造模周期，同时，肝癌模型的成功建立与人类肝癌的发病过程类似，对研究人类肝癌的发病有一定价值。
（3）NAFLD诱导的肝癌模型：非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是代谢综合征在肝脏的表现形式，与肥胖、胰岛素抵抗、空腹血糖升高、血脂异常、脂肪因子变异等机体代谢异常明显相关，是目前慢性肝病最常见的病因。NAFLD是以过量的脂质在肝细胞内堆积为特征的连续疾病谱，可由单纯的肝脂肪变性发展为非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），严重时可发展为肝纤维化和肝硬化，NASH一旦合并肝纤维化或肝硬化，则可进一步增加肝细胞癌的发生风险。
①NAFLD饮食诱导的肝癌模型：单纯以1种饮食喂养的动物模型均有不同的局限性，以高脂饲料喂养的C57BL/6鼠不能显现与NASH相似的病理学改变，而以蛋氨酸-胆碱缺乏或胆碱缺乏饮食喂养的小鼠却可以显现，但不能诱导代谢综合征和肥胖的特征。因此，Wolf等提出1个混合饮食模型，即胆碱缺乏饮食和高脂饮食混合（CDHFD）。肝脂肪变、肝损伤、ALT和AST水平上升等改变，可同时存在于这种新型模型中。高脂饮食鼠肿瘤发生率只有2.5%，而CD-HFD鼠肿瘤发生率可提高到25%。
在另一种联合饮食模型中，以胆碱缺乏的L-氨基酸饮食（choline-deficient L-amino acid-defined diet，CDAA）喂养的小鼠可发展为肝损伤，能反映NASH特征，并导致肝癌。以CDAA喂养小鼠可诱导小鼠胰岛素抵抗和肝脂肪变性增加，糖类和脂质代谢酶改变，并可诱导肝损伤和纤维化，甚至小鼠在被喂养9个月后可发展为肝癌。
有学者报道NAFLD的饮食诱导肝癌动物模型，是由C57BL/6J鼠和129S1/SvlmK鼠产生的同基因品系B6/129，其可以具备NASH相关肝癌患者的关键特征。以高脂肪和高糖混合饮食喂养的B6/129鼠可循序在4~8周发展为脂肪变性，16~24周发展为NASH，52周后发展为肝癌，这种模型是NASH相关肝癌的一种理想的临床前动物模型。
以CDAA饮食喂养并给予腹膜内注射CCl4的C57BL/6鼠具有更显著的NASH和肝癌特征，此类鼠比单一CDAA喂养的鼠有更严重的脂肪变性、肝小叶炎症和纤维化形成。此外，仅35%的CDAA喂养的C57BL/6鼠发展为肝癌，但所有CDAA联合CCl4的小鼠均发展为肝癌，并且肿瘤的平均直径更大。
有研究报道，1种联合诱导肝癌动物模型是以高脂饮食喂养并进一步给予链脲霉素（streptozocin，STZ）治疗的C57BL/6鼠，STZ是1种氨基葡萄糖亚硝基脲合成物，对胰岛B细胞有毒性作用，可在小鼠中诱导低胰岛素血症、高血糖症和糖尿病。以高脂饮食刺激STZ小鼠可诱导肝脏组织学改变，包括脂肪变性、小叶炎症、纤维化，并在20周时出现肿瘤性突出物。其他与人类NASH类似的特征包括体重增加、空腹血糖上升和ALT升高。雄性STZ高脂饮食小鼠在16周时出现肝细胞大量增殖，最终发展为肝癌。这种模型为研究代谢紊乱、NASH及肝癌的相关机制提供了方式。
②先天性NAFLD诱导型肝癌模型：同源性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）基因是1种肿瘤抑制基因，其缺乏将导致细胞过度增殖、凋亡减少、肿瘤形成。肝脏特异性PTEN缺乏鼠可进展成与人类相似的NASH和NASH相关的肝癌。66%雄性和30%雌性PTEN缺乏鼠可在40~44周后出现肝内肿瘤，83%雄性和50%雌性PTEN缺乏鼠可在74~78周后出现肝癌。因此，这种模型有助于了解NASH的发病机制，也有助于了解NASH到肝癌的发展进程。
③联合基因和化学物质诱导的NAFLD相关肝癌模型：先天性肥胖是db/db鼠的NASH相关性肝癌进展的直接促发因素。以致癌物质二乙基亚硝胺处理的小鼠在13~15天龄时出现体重增加、肝重量增加、肝脂肪变性，同时也出现更高的肝癌发生率及更多、更大的肿瘤。这也为肥胖和NASH增加肝癌易感性的相关研究提供了依据。
（4）其他：能够成功诱导建立肝癌动物模型的化学因素还有许多种，如二甲基氨基偶氮苯、2-乙酰氨基芴、亚氨基偶氮甲苯等，在诱导建模的方法中，既有单一因素的诱导，又有多因素的联合诱导。同时，在近年来不断创新改进后，在诱导阶段结合手术干预，使动物肝癌模型的建立周期更加缩短，最常见的一种方法是Solt-Farber模型法。尽管国外许多学者在Solt-Farber模型法的基础上进行了改进，如改变给药剂量、给药方式或手术干预的时间，不同程度地缩短了建模时间，但是建模成功率、稳定性也受到影响，仍不是非常满意的肝癌动物模型。所有诱导性模型的建立，最开始都是化学因素作用，然后在建立模型过程中增加作用因素，最终形成肝癌；其中，大多数化学因素诱导建模的肝癌起病隐匿、建模周期长，常需要一段作用时间，一般半年左右，时间更长的甚至需要1~2年。大多数化学因素诱导建模的过程会有短时间内动物模型病死率高的情况，而且肝癌出现的时间、部位、病灶数等在个体之间差异较大。(https://www.daowen.com)
3.基因修饰模型
（1）肝炎病毒转基因模型：已有充分证据表明HBV是人类肝炎和肝癌发生的重要原因。由于HBV一般不感染培养的细胞，也不感染常用的实验动物，因而在一定程度上限制了对其致病机制的研究，而转基因技术则为HBV致病机制和治疗性疫苗筛选等方面的研究提供了新的研究途径。近年，我国也开展了建立乙型肝炎病毒（ayw亚型和adr亚型）转基因小鼠模型的研究，并获得成功。
HBx抗原作为HBV编码的病毒反式激活因子，具有控制转录过程、调节其他病毒基因表达的功能，并能通过影响宿主的生物合成，干扰基因的表达和细胞分化，从而诱导肝癌的发生。已有研究证实，HBx转基因的单独表达能诱导小鼠肝癌的形成。Kim等建立了HBx转基因小鼠肝癌模型，将1.15kb HBV亚型adr DNA片段通过显微注射法转入CD1小鼠单细胞受精卵，使其整合于宿主基因组中，通过分析小鼠不同组织HBx蛋白的表达水平发现，在肝、肾和睾丸组织中有0.7kb DNA片段的相对高水平表达，这种HBV DNA序列在肝和肾组织中的选择性表达与感染HBV的人体情况相同。对转基因小鼠肝脏的组织学检查发现，小鼠在4月龄时出现肝细胞异常改变的多病灶区，但细胞增殖程度并没有明显增加，病灶内的肝细胞有HBx蛋白的高水平表达。8~10月龄时，肝脏出现肿瘤，具有肝细胞腺瘤的特点，肿瘤内肝细胞的HBx蛋白处于高水平表达，同时检测AFP呈阳性。11~15月龄时，大部分的雄性转基因小鼠死亡，而雌性小鼠大约在17~21月龄才出现死亡。解剖分析发现，所有小鼠的肝脏都出现肿瘤，病理诊断为肝细胞癌，癌组织仍有HBx蛋白和AFP的高表达，部分动物出现肝癌转移。该模型的肝癌发生情况存在明显的性别差异，肝癌发病率分别为雄性小鼠90%，雌性小鼠60%。流行病学资料显示，慢性HBV感染的男性患者比女性患者更易于形成肝癌，说明由HBV感染而引起的肝癌确实存在着性别差异。Yu等在HBx转基因小鼠肝癌模型研究中发现，6月龄时，小鼠肝脏出现不典型增生小结节，11~18月龄时发展为肝细胞癌，该模型的肿瘤发生率为86%。检测HBx蛋白表达情况，Yu等发现HBx蛋白在非转基因小鼠肝细胞中不表达，在转基因小鼠发育不良和不典型增生的肝细胞中呈高表达，但两者之间没有显著差异；在非转基因小鼠肝组织中未检出增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）阳性细胞，而转基因小鼠不典型增生肝结节和肝细胞癌组织的PCNA阳性细胞数显著增加，与发育不良的肝组织相比有显著差异。
整合有Alb/HBVBg/Ⅱ-A基因片段的HBV转基因小鼠肝癌模型的病理特点主要是慢性肝细胞损伤、感染所致的不典型增生和染色体异常，并最终形成肝细胞癌。研究发现，在病变早期，增生的肝细胞和肿瘤中的HBV基因表达水平降低，形成肝细胞癌后AFP检查呈阳性。这一模型的病变过程，即损伤→再生→肝癌，能比较准确地反映感染HBV所致的人肝细胞癌的发展过程，为进一步研究人HBV相关性肝癌的发生机制提供更理想的手段。
在转基因小鼠表达HCV核心结构蛋白的模型中，小鼠感染HCV后，在第60周后被检测出肝脏形成肝癌，研究者们推断其原理是HCV核心E1、E2和P1结构蛋白的基因表达，使肝细胞进一步癌变，从而形成肝癌。
（2）PTEN基因敲除：目前，研究者们已经确定了PTEN基因参与细胞生存、增殖、能量代谢及细胞结构等，同时发现PTEN基因丧失会导致多种肿瘤模型的出现。研究者们在小鼠实验时发现，敲除PTEN基因后，该小鼠会逐步出现肝细胞脂肪变性，同时也诱导脂肪生成相关基因的表达，形成脂肪性肝炎和肝纤维化，然后进展为肝癌。研究者们可以初步推测，这种肝癌模型的建立与人类肥胖、脂肪肝进展成肝癌有相似之处。但是这种建模方法也存在缺点，一方面，PTEN基因被敲除后，有可能出现多器官的肿瘤模型，并不是单一的肝癌动物模型，不利于后期的实验研究；另一方面，对实验者的技术要求高，同时需要花费大量时间与精力，无法满足建模样本数量大的要求。
（3）转化生长因子β激活激酶1（TAK1）基因敲除：TAK1基因是维持细胞稳态的1个重要组成部分，它属于促分裂原活化蛋白激酶的家族成员之一，该基因在肝脏中激活NF-κB通路，参与肝细胞的增殖、致癌和死亡过程。在探索建立基因敲除肝癌动物模型的方法后，研究者们又发现1种敲除TAK1基因的造模方法，在敲除TAK1基因后，早期测量小鼠血清谷丙转氨酶升高，中后期显著上升，继而导致小鼠肝细胞的凋亡，在大约4个月的时间内，肝细胞逐步发生炎性改变、纤维化、代偿性的细胞增殖，最终形成肝癌。
（4）多药耐药（MDR）蛋白2基因敲除：MDR2基因可以编码一种促进胆汁中胆盐溶解的膜磷脂，小鼠MDR2基因被敲除，可导致小鼠胆汁淤积，表现为胆汁流量减少，胆汁分泌减少，肝脏中高浓度的胆盐损伤肝细胞，在2~3周时开始出现肝细胞炎症反应和胆管增生，逐步发展为肝纤维化，在第18周时出现肝癌细胞。这种小鼠肝癌模型的建立证明促进肝细胞炎症反应能抑制NF-κB通路，促进小鼠肝癌的发生。该方法的肝癌发病过程类似于人类MDR3缺陷症，该方法对研究这种疾病有一定帮助，但是建模成功率并不是非常理想，部分动物模型只发展到肝硬化程度，未完全形成肝癌，所以对研究肝炎—肝硬化的演变过程有一定的意义。
（5）猿猴空泡病毒40（SV40）转基因肝癌模型：不同启动子的SV40转基因动物可以发生不同部位的细胞异常，如胰岛素基因启动子调节下的SV40基因引起胰腺瘤，抗凝血酶Ⅲ（antithrombinⅢ，ATⅢ）基因增强子调节下的SV40基因可引起肝癌。有研究利用人ATⅢ基因和SV40 TAg序列构建的外源DNA，建立了SV40转基因小鼠肝癌模型。研究发现，2月龄前小鼠肝脏出现有丝分裂异常，4月龄时出现许多界限分明的肿瘤小结节，6月龄时发展为肝细胞腺瘤，并在结节周围出现发育不良的肝细胞。与人体的肝细胞腺瘤不同，该模型没有表现出任何肝硬化的征象。7月龄为肝癌发展的晚期，其肝重可为正常肝脏的15倍，同时伴有许多坏死区，肝脏结构被完全破坏。这些转基因小鼠的生存期很少超过10个月，大部分在8月龄时死亡，其肿瘤发生率为100%。与其他转基因肝癌动物模型不同的是，该模型的部分动物出现了肺转移，说明ATⅢ-SV40 TAg转基因诱导的肿瘤恶性程度较高。研究者们分析转基因的表达水平，发现SV40 TAg mRNA的表达在出生时很低，1周后急剧上升，而且仅局限于肝脏，增生结节内转基因的mRNA和蛋白表达水平高于非增生区。在肝癌晚期，肝脏病变区内的转基因表达水平明显降低，但肺转移肿瘤的转基因表达水平显著提高。鸟氨酸转氨甲酰酶作为肝分化的敏感标志物，7月龄前可在肿瘤、结节和周围细胞中被检测到其mRNA表达，随后表达水平下降，但在肺转移肿瘤中仍有明显表达。
许多研究表明，IGF-Ⅱ（insulin-like growth factor-Ⅱ）mRNA在人和大鼠肝癌中有高表达，并与肝细胞分化程度密切相关。研究者们在该模型中检测IGF-Ⅱ表达水平，发现大鼠从出生到2周龄，其IGF-Ⅱ mRNA呈高表达，3周龄以后表达消失，直到3月龄时肝结节中又有IGF-Ⅱ mRNA高表达，而周围肝细胞不表达。在随后的4、5、6和7月龄时，转基因肝组织IGF-Ⅱ mRNA表达又为阴性，说明IGF-Ⅱ mRNA是在肝癌发展的特定阶段被激活，并可能作为肝癌前病变的标志物。
（6）TGFα/c-Myc转基因小鼠肝癌模型：将构建的4.5kb Alb/c-Myc基因转入（C57BL/6J×CBA/J）F1受精卵，培育Alb/c-Myc转基因小鼠；将构建的2.3kb EcoRIMT TGFα基因转入CD1受精卵，培育MT/TGFα转基因小鼠；将两种转基因小鼠进行交配，获得TGFα/c-Myc转基因小鼠。研究表明，与单独表达Alb/c-Myc或MT/TGFα转基因动物相比，这种双转入的c-Myc和TGFα基因在小鼠肝脏表达的同时会加速肝脏肿瘤形成。单独整合有Alb增强子/启动子的c-Myc转基因小鼠在2月龄前表现出不同程度的肝细胞发育不良，12月龄时没有发现肝增生结节，15~18个月时部分小鼠出现肝细胞腺瘤；MT/TGFα转基因小鼠在10~15月龄时才能诱导产生多灶性分化良好的肝细胞癌。而TGFα/c-Myc转基因小鼠在6周龄时，就出现明显的肝细胞发育异常，表现为核仁密集、染色质浓缩等细胞凋亡的征象。到9周龄时，大约80%的转基因小鼠都出现这类损伤，并形成很多发育不良的细胞灶。19周龄以后，70%的转基因雄性小鼠肝脏出现单一或多灶性肿瘤结节，病理分析为分化良好的肝细胞癌。而在此阶段，c-Myc或TGFα转基因小鼠肝脏均无相应的病变损伤。在整个实验期内，相同月龄的（C57BL/6J×CBA/J）×CD1野生型（WT）小鼠肝脏未见肿瘤形成。
（7）其他：在肝癌动物模型的研究过程中，还有SV40转基因小鼠肝癌动物模型、转化生长因子转基因小鼠模型等；在基因修饰的动物模型中，各国的研究者们并没有仅限于啮齿动物的研究，在其他非啮齿动物上也有很多研究，如通过对斑马鱼模型进行基因修饰，对肝癌疾病有了进一步的了解。目前基因修饰肝癌动物模型的制作技术要求极高，价格昂贵，虽然基因修饰肝癌动物模型可以诱导肝癌的发生，但其主要还是用于研究基因改变对肝癌形成的影响。目前基因修饰模型在国内开展还比较少，但其为肝癌的基础理论研究和临床应用开辟了更理想的研究途径，具有广阔的前景，是肝癌动物模型未来发展的方向。
二、肝癌前动物模型
1.CCL4诱发肝硬化基础上的肝癌动物模型 研究者按0.5mL/kg给雄性F-344鼠通过强喂法饲以CCL4，每周3次，同时在饮水中加0.05%的苯巴比妥钠，连续6周；在此之前，通过静脉按200 mg/kg注射二甲基亚硝胺2周；16周后即可获得100%的肝硬化和肝癌同时发生的动物模型。该模型的肝硬化主要是由肝小叶的带状坏死引起的。由于个体差异，不同的个体对这种化学物质的反应不同，并且CCL4诱导的肝硬化和人类乙型肝炎肝硬化不同，而乙型肝炎肝硬化是和肝癌的发生联系最为紧密的一种类型。因而，很显然，CCL4诱导的肝硬化模型并不适于研究肝炎后肝硬化与肝癌发生的关系。通过病理形态学和胶原代谢的生化学对CCL4诱导的实验性肝硬化和人类肝硬化进行比较，研究者们也认为通过CCL4产生的实验性肝硬化并不能作为合适的人类肝硬化模型，但该模型可在短期内产生肝硬化的继发症状，对研究肝硬化及其继发症状的药物阻断和化学性肝硬化向肝癌转化的发生机制有一定的意义。
2.单一化学药物诱导的肝硬化肝癌动物模型 低剂量长期应用致癌物可诱发肝癌，大剂量可引起肝坏死和纤维化。常用的有硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）、二甲基亚硝胺（DMNA）、二乙基亚硝胺（DENA）。DMNA进入肝细胞，经微粒体代谢生成乙醛，引起肝细胞损害，同时产生活化的甲基，使核酸、蛋白质甲基化，导致肝坏死，实验4周后可发生肝纤维化，停药后可持续4个月，较稳定。于饮水中加入0.03% TAA，3个月肝硬化形成率为100%，死亡率为20%。TAA在肝内代谢为硫氧化物，与肝内大分子物质结合，引起肝损伤，同时还可激活磷脂酶A2，破坏肝细胞膜，导致肝坏死。致癌物诱发肝纤维化，一般较稳定。以DENA诱导肝硬化到肝癌模型为例，取Wistar大鼠，8周龄，重约200g，自由进食，腹腔内注射DENA，按100mg/kg，每周1次，于注射后第7周即可形成肝硬化肝癌。该模型可用于研究肝硬化向肝癌转化的机制及药物作用机制。
3.糖醛诱发肝硬化基础上的肝癌动物模型 长期口服糖醛导致的肝硬化改变进程类似于人类慢性活动性肝炎导致门脉性肝硬化的过程，这种肝硬化表现为格林森氏鞘的增宽，桥接坏死和/或桥接纤维化，而少有块状坏死。通过糖醛诱导肝硬化需要相当长的时间，而这种特征也类似于人类肝硬化的发展过程。很多人尝试通过CCL4诱导实验性肝硬化。比较这些尝试，釆用糖醛诱导肝硬化更可靠易行，不需任何特殊的技术，实验动物死亡率低。糖醛是一种非致癌物，目前的数据表明，糖醛诱导的肝硬化模型是研究肝硬化和肝癌发生关系的合适模型。
取雄性SPF Wistar/SIc大鼠，6周龄。实验组饲以糖醛饮食120天，而对照组饲以无糖醛饮食。第1~7天，糖醛饲料给予量按20mL/kg，第8~14天30mL/kg，第15~90天40mL/kg。从第91天到实验结束（即第120天），按每周前2天基本饮食，后5天40mL/kg糖醛饮食循环，以避免体重的严重消耗。研究者在第90~120天即可观察到肝硬化改变。有学者曾通过上述的口服糖醛诱导的肝硬化模型和2-FAA研究肝硬化对化学物诱癌的影响。
4.营养不良性肝硬化基础上的肝癌动物模型 肿瘤发生不仅是由外界因素所致，而且与内在的基因型和渐成影响有关。由于没有合适的在体实验动物模型，后者的机制还未得到阐明。有学者提出了一种内在的鼠肝癌发生模型，其饮食配方为胆碱缺乏的低蛋氨酸饮食（CDML），经此饮食喂养一段时间的大鼠会发展为脂肪肝、肝细胞损伤、肝纤维化、肝硬化，直至肝癌。Nakae等发展了CDAA，代替了CDML的半合成产品，同样能导致肝癌的发生和肝脏DNA的氧化损伤。这种模型的建立有助于进一步研究和阐明肝癌发生的内在致病因素和发病机制。
5.病证结合的肝癌动物模型 肝癌归属中医学“肝积”“积聚”“癥瘕”“黄疸”“鼓胀”等病范畴，中医认为，肝癌是以脏腑气血亏虚为本，气、血、湿、热、瘀、毒互结为标，主病在肝，渐成癥积。临床主要有肝气郁结证、气滞血瘀证、湿热聚毒证、肝阴亏虚证。在中医药抗肝癌研究中，具有中医特色的病证结合肝癌动物模型为中医药治疗肝癌提供了中医理论依据，同时还为以中医理论探索肝癌的演变规律提供某种依据，比单纯的肝癌动物模型更具说服力。目前，国内研究的病证结合肝癌动物模型主要有脾虚证肝癌动物模型和湿热证肝癌动物模型。
（1）脾虚证肝癌动物模型：中医学认为肿瘤的发生是由于机体正气虚弱，邪气乘虚而入，因虚而致瘀是肝癌的本质。耗气、破气加饥饱失常可诱发实验动物脾气虚，再结合肝癌细胞注射，可使实验动物表现为脾气虚证肝癌。李锦毅等采用厚朴、大黄水煎液灌胃昆明种小鼠，隔日加喂猪脂，每只小鼠灌胃1mL水煎液，造模9天，于第10天取肝癌H22腹水型小鼠的腹水，无菌抽取生长良好的乳白色腹水，用生理盐水1∶3稀释，在每只小鼠右前肢腋下皮下注射，连续接种7天，建立脾气虚证肝癌动物模型。从第5天起，小鼠表现为倦怠、脱肛、肠胀气、消瘦、便溏等脾气虚症状，接种7天后肿瘤明显增重。
用泻下法致脾虚是脾虚证模型最常用的造模方法，其中，绝大多数为苦寒泻下法。早在1983年，于尔辛等用纯系雌性BALB/c小鼠，以大黄芒硝合剂灌胃9天后，在小鼠腹外侧皮内接种腹水型肝癌（HAC）细胞6×106个，小鼠于胃饲大黄芒硝合剂后第2~3天起出现大便软溏，并持续腹泻，第4~5天起形体消瘦，活动少，毛散乱无华，四肢冷，形成一系列脾虚的症状，接种HAC细胞后2~3天，脾虚小鼠可出现瘤块。给大鼠灌服大黄水煎剂（1g/mL），4 mL/次，2次/天，连续14天。然后将Walker-256瘤株复苏，注入幼鼠腹腔，生长癌性腹水；取癌性腹水离心弃上清，将浓缩癌性腹水注入大鼠肝脏，模型大鼠出现精神萎靡、被毛张开、食欲减退、体重减轻、腹泻、动作无力、成群蜷卧、毛疏散竖立等脾虚症状。造模1周后进行B超检查，多数造模大鼠肝内可见到1个或数个高密度回声区，将大鼠处死后进行剖腹探查，肝脏内发现直径0.5~1.0cm大小不等的实体肿瘤。血清ALT、AST、总胆红素（TBIL）、碱性磷酸酶（AKP）均升高，白蛋白（Alb）降低。用同法建立脾虚证肝癌动物模型，肝癌脾虚证组野生型p53 mRNA阳性表达率显著低于正常对照组，N-ras蛋白阳性表达水平与正常对照组相比显著升高，证实野生型p53 mRNA、N-ras异常表达与脾虚证具有相关性，野生型p53 mRNA表达率显著降低是肝癌脾虚证的特征之一。这一研究从分子水平更加深刻地认识了肝癌中医证候的科学内涵，对提高肝癌辨证论治水平、充分发挥中医药治疗原发性肝癌的优势有重要意义。
（2）湿热证肝癌动物模型：肝癌的初中期多为湿热证。高糖高脂饲料喂养、湿热环境、灌胃细菌可致实验动物产生湿热症状，结合肿瘤细胞直接注射法可建立湿热证肝癌动物模型。将Walker-256肿瘤细胞株注射入大鼠皮下，长出皮下实体瘤，取瘤体周边组织剪成2mm3小块，将瘤块植入肝脏包膜下，同时给予高糖高脂饲料饲养，置于高温高湿环境。结果肝癌湿热证组大鼠出现毛发蓬松、倦怠呆卧、进食少、饮水少、行动呆滞等症状。造模1周后进行B超检查，多数造模大鼠肝内可见到1个或数个高密度回声区，将大鼠处死后进行剖腹探查，肝脏内发现直径0.5~1.0cm大小不等的实体肿瘤。造模成功后，大鼠的细胞凋亡率、p53、肿瘤微血管密度（MVD）、血管内皮生长因子（VEGF）均升高。用同法造模，模型大鼠出现毛发蓬松、倦怠呆卧、进食少等症状，B超均见lcm左右高密度回声区，将大鼠处死后进行剖腹探查，肝脏植瘤术处均见直径0.5~1.0cm大小不等的实体瘤，肝脏术口附近或邻近肝叶见1个或数个小转移灶，造模成功后大鼠的AST、ALT、IL-8比正常组高，血清中的IL-2、TGF-α亦比正常组高。
对大鼠采用高糖高脂饲料喂养10天，然后将大鼠置于造模箱中，于第96小时以伤寒沙门菌灌胃1次，第120小时再灌胃1次，之后移出置于自然环境中。后将Walker-256瘤株复苏，注入幼鼠腹腔生长癌性腹水；取癌性腹水离心弃上清，直接将浓缩癌性腹水注入大鼠肝脏。造模后大鼠出现毛发蓬松、倦怠呆卧、进食少、饮水少、行动呆滞等症状。造模1周后进行B超检查，多数造模大鼠肝内可见到1个或数个高密度回声区，将大鼠处死后进行剖腹探查，肝脏内发现直径0.5~1.0cm大小不等的实体肿瘤；血清ALT、AST、TBIL、AKP均升高，Alb降低。用同法建立湿热证肝癌动物模型，肝癌湿热证组N-ras蛋白阳性表达水平与正常对照组相比显著升高。
病证结合肝癌动物模型包括2方面的内容：一方面是将现代医学的人类疾病动物模型与中医证候动物模型嫁接，建立病证结合动物模型；另一方面是在中医药病证理论指导下，建立中医病证结合动物模型。