清热解毒类中药的基础研究
在肝癌的发病过程中，热毒是疾病进展的中心环节，临床常见的局部肿块灼热疼痛、口渴尿赤、舌苔黄腻等症状，多为热毒蕴积于体内所致。
一、清热解毒法的现代医学阐述
近代许多研究证实清热解毒法既能解“外源性之毒”，即细菌、病毒和内毒素，还能解“内源性之毒”，即氧自由基和炎性细胞因子。研究者应用频数分析、聚类分析和关联规则分析进行数据挖掘，分析60多位国医大师和百位名中医临床治疗肝癌的用药，发现清热解毒类中药位列17类不同功效中药的第2位，由此可见，清热解毒法在原发性肝癌的治疗中起着重要作用。清热解毒类中药具有预防术后复发、提高生活质量、延长生存期、提高生存率、增效减毒等作用。2010版《中华人民共和国药典》共收载功效为清热解毒的中药材72种，经文献检索发现，其中有45种已被报道具有抗肿瘤活性，如人工牛黄、三白草、大血藤、大青叶、山豆根、山慈菇、千里光、飞扬草、马齿苋、云芝、升麻、水飞蓟、甘草、北豆根、白头翁、白蔹、冬凌草、半边莲、半枝莲、地锦草、连翘、忍冬藤、青黛、苦木、板蓝根、虎杖、垂盆草、金荞麦、鱼腥草、南板蓝根、鸦胆子、重楼、穿心莲、射干、益母草、通关藤、黄连、菊花、野菊花、紫萁贯众、筋骨草、蒲公英、锦灯笼、漏芦、翻白草等。清热解毒类中药主要适用于疔疮痈肿、丹毒、瘟毒发斑、痄腮、咽喉肿痛、热毒下痢、虫蛇咬伤、癌肿、水火烫伤及其他急性热病等。作为清热解毒法的物质基础，清热解毒类中药能够抗病原微生物、抗内毒素、抗炎、提高机体免疫力，在预防和治疗恶性肿瘤过程中起着不可替代的作用。在中医临床上，有许多用于治疗恶性肿瘤的清热解毒类制剂，如云芝多糖、水飞蓟宾胶囊和鸦胆子油乳注射液等。现代药理研究表明，清热解毒类中药可以通过直接抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、逆转多药耐药、调节和增强机体的免疫力、诱导细胞的分化与逆转、抗突变等作用达到抗肿瘤的目的。清热解毒类中药对肝癌晚期的热毒之证，如局部红肿热痛、全身发热、口渴、尿赤、便秘等相关症状，具有一定程度的改善作用，同时对肿瘤的放疗、热疗等局部治疗有增效减毒作用。
清热解毒类中药亦可通过抑制炎症、调控肝癌微环境治疗肝癌。现代医学中所谓的炎症是指机体组织形态、结构发生不同程度的损伤、充血、肿胀、渗出、变性，包括血管坏死或增生栓塞，局部组织缺血、缺氧且伴有代谢机能改变、循环障碍、血流变异等过程，这与中医所讲的热毒密切相关。炎症与肿瘤发生发展的关系有着深远的历史背景，早在1863年，德国著名病理学家鲁道夫·魏尔肖证实了炎性细胞和细胞因子有助于肿瘤生长，从而提出肿瘤可能起源于慢性炎症这一假说，但直到21世纪初，炎症与肿瘤的关系才引起研究者们的重视。有报道指出，促进伤口愈合的炎症反应免疫细胞与肿瘤的恶化相关，它们会在某方面促进肿瘤生长，并帮助癌细胞转移到其他组织，即可以认为当微环境处于炎症状态时，免疫细胞有可能起到对机体不利的作用。近年来，人们在探索炎症与肿瘤关系的同时也开始从炎症的角度寻找治疗肿瘤的新方法。肿瘤微环境中的炎症因子有多种促肿瘤作用，可以促进肿瘤细胞的增殖，促进血管新生和转移，削弱机体的免疫反应，改变机体对激素和化疗药物的反应。在肿瘤进展的晚期，肿瘤细胞通过调控炎症因子促进肿瘤的播散和转移。中医药的发展秉承对中药机理的研究和探讨，在此我们总结了中药抗肿瘤的作用机制。
二、清热解毒类中药抑制肿瘤细胞增殖
1.肝癌细胞的增殖特点 肝癌细胞的增殖与分化受一系列细胞周期正负调节因子的调控，这些调节因子通过相互作用保证细胞周期的正常进行，从而完成细胞增殖。真核生物的细胞周期是以G1—S—G2—M期为过程。细胞周期有2个重要调控点，G1/S和G2/M，其过程受细胞周期相关蛋白调控。其中，G1/S调控点是对细胞增殖进行调控的关键之一，由细胞周期蛋白-周期蛋白依赖性激酶-周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白成视网膜细胞瘤蛋白（cyclin-cyclin dependent kinase-cyclin dependent kinase inhibitorretinoblastoma protein，cyclin-CDK-CDKI-Rb）调节系统来调控，此调节系统中的任何环节发生异常，均可导致细胞异常增生甚至癌变。细胞周期蛋白（cyclin）是在细胞周期中规律性地合成，又规律性地降解，且能与周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）结合并激活其催化亚单位的结构同源性蛋白质。cyclin与CDK结合形成活化的cyclin/CDK复合体，促使细胞进入增殖周期，处于细胞周期调节的中心环节。其调节作用是由参与细胞周期过渡的关键蛋白质——成视网膜细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，Rb）的磷酸化来实现的。人的细胞中与G1/S调控点相关的细胞周期蛋白有cyclin D和cyclin E。cyclin D基因家族至少有3个成员，D1、D2、D3，它们在结构和功能上具有一定的相似性。cyclin D的合成和表达依赖生长因子，在G1期达到其合成和活性的高峰，能与CDK4或CDK6特异性结合，形成cyclin D-CDK4/CDK6活性复合物。此复合物促进Rb磷酸化，使细胞由G1期进入S期。研究显示，cyclin D1的基因扩增和过度表达是较常见的致癌性变化，且与肝癌的发生发展有关。cyclin D1基因在45例肝癌中扩增的发生率是11％，并与其信使核糖核酸（messager ribonucleic acid，mRNA）的过度表达相关。cyclin D1基因扩增发生在肿瘤生长快的进展期肝癌，提示其与肿瘤的侵袭性行为有关。在对104例肝癌标本的临床调查中发现，32.6％的标本呈cyclin D1过度表达，因而认为cyclin D1在G1/S调控点发挥重要作用。研究者通过分析cyclin D1在乙型病毒性肝炎相关性肝癌患者中的表达情况发现，cyclin D1的过度表达与临床分期高、分化程度差、微血管侵犯、肝内转移等显著相关。最近有学者在用无环维生素A抑制肝癌细胞株生长的实验中发现，在无环维生素A引起肝癌细胞增殖受阻的同时，cyclin D1的表达水平下降，其mRNA水平也下降。继cyclin D1之后，人们发现细胞周期蛋白E（cyclin E）的合成开始于G1后期。cyclin E在G1/S期转变过程中也具有重要的调节作用。cyclin E与CDK2结合形成的cyclin E/CDK2复合物，是启动S期的蛋白激酶，对维持Rb磷酸化很重要。有研究表明，在大部分肿瘤患者中，cyclin E的表达增高，cyclin E在35.5％的肝癌患者中过度表达，且其表达程度与病理分期显著相关。有研究表明，在人的肝癌中，cyclin E和CDK2同时过度表达，相关分析表明，cyclin E的过度表达与肿瘤分期显著相关，CDK2的过度表达与肝癌预后差有关，提示cyclin E和CDK2在肝癌进展中发挥重要作用。周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白（cyclin dependent kinase inhibitor，CDKI）阻止cyclin/CDK复合物的形成和活化，从而抑制Rb磷酸化，阻止细胞进入S期，使其停滞于G1期，对细胞周期具有负调控作用。
除上述细胞周期相关蛋白之外，还有1套被称为细胞周期检测点的检测修复机制，可通过不同通路直接介导受损DNA的检测与修复，最终保证DNA的复制和染色体的分配质量。目前，细胞周期检测点主要包括2个激酶：Chkl和Chk2。二者均为蛋白激酶，在DNA的损伤修复调节通路中发挥着至关重要的作用，其表达紊乱可能与多种肿瘤（尤其是肝癌）相关。Chk1在DNA损伤后的细胞周期检测点调节与DNA修复后的细胞周期重新启动中均发挥着重要作用。此外，Chk1作为1种结构活性酶，与染色质的结构稳定性密切相关。Chk1的mRNA和蛋白表达主要发生于细胞周期的S期和G2期，并参与细胞内染色体和纺锤体的装配。正常表达的Chk1通常对人类体细胞的生长无显著影响，有利于确保DNA复制的稳定。Chk1如果发生基因突变或表达异常，则会影响DNA的损伤修复，最终导致DNA复制不完全或细胞凋亡等，甚至可能导致子代细胞携带错误基因，并逃脱细胞周期检测点继续生长增殖，从而增加细胞发生恶性转化的风险。Chk1不仅是S期和G2期必需的，也是有丝分裂、胞质分裂及完全的细胞分离不可缺少的。当发生DNA受损时，Chk1可诱导细胞周期延迟或阻滞，为DNA损伤修复提供时间。Chk1作为细胞周期检测点重要的调节蛋白之一，其稳定表达有利于维护DNA的损伤修复，进而保证整个细胞基因组的完整稳定。因此，从其功能上看，Chk1可被认为属于肿瘤抑制因子。也有研究发现，当Chk1基因失活呈现单倍体剂量不足时，DNA损伤在复制中不断累积，进而促使本该停止生长增殖或发生生理性凋亡的细胞持续进入细胞周期，最终导致细胞恶性增殖的发生。同Chk1一样，Chk2在DNA损伤后的细胞周期检测点调节中发挥着重要作用，有利于受损DNA的修复，同时维持染色体的相对稳定。和Chk1一样，Chk2广泛表达于人类和多种生物的正常组织细胞中，尤其是细胞核中。因此，细胞核也是Chk2发挥作用的重要场所。Chk2蛋白可在细胞周期的不同阶段表达，具有显著的组织特异性，是细胞内DNA损伤修复通路中另一个重要的信号转导蛋白，可通过ATM依赖性和非依赖性方式促使下游不同的靶蛋白激活G1/S期和（或）G2/M期检测点，进而阻滞细胞周期进程，激活修复相关基因的转录，完成对受损DNA的修复，维持细胞染色体的稳定。因此，在人类某些散发和遗传性肿瘤的发生、发展中，Chk2可能发挥着一定的作用，也表明Chk2在细胞周期进程中发挥着重要的负调控作用。在细胞无DNA受损时，大部分Chk2以无活性单体状态均匀分布于细胞核内，但在DNA受损尤其是发生DNA双链断裂损伤后，细胞则主要通过ATMChk2-CDC25信号转导通路作用于G1/S期、S期或G2/M期不同的细胞周期检测点，及时阻滞细胞周期进程，对受损DNA进行修复调节。如果出现Chk2激酶无法实现对细胞DNA损伤的修复调节，Chk2将诱导DNA损伤发生p53依赖性或p53非依赖性细胞凋亡。Rb基因作为cyclin D-CDK4/CDK6和cyclin E/CDK2复合物的底物，其磷酸化对细胞周期在G1/S调控点的调控作用是关键的。当Rb被磷酸化时，其与转录因子E2F结合的能力减弱，E2F被释放，启动多种细胞周期进行必需的基因的转录，细胞进入S期。CDK1则通过抑制cyclin D-CDK4/CDK6和cyclin E/CDK2复合物的活性，抑制Rb磷酸化，将细胞阻滞于G1期。肝癌中Rb表达缺失占28％，由此认为，Rb失活与肝癌的发生有关。肝癌中Rb基因异常是很常见的，13q染色体杂合性缺失的发生率为35％，而Rb基因正定位于染色体该区带。
2.清热解毒类中药抑制肝癌细胞增殖 从大量实验研究中我们可以看出，中药对控制肿瘤细胞增殖有积极作用。研究报道珠子参对肝癌H22小鼠具有良好的抑瘤作用，其作用机制可能与珠子参阻止G2/M期细胞转换，进而影响癌细胞的细胞周期进程，干扰S期DNA合成，直至诱导小鼠肝癌细胞凋亡有关。白花蛇舌草水提液可能是通过下调人肝癌HepG2细胞CDK2、E2F1 mRNA的表达将细胞阻滞于G0/G1期，进而抑制其增殖。藤梨根总黄酮苷（111g/kg）可减轻皮下接种肝癌H22细胞的小鼠模型的瘤重，抑瘤率达34.62%。而就抑制肝癌Bel-7402细胞的增殖而言，藤梨根氯仿提取物作用最强，其甲醇提取物次之。体内实验研究还证实，藤梨根氯仿提取物可有效抑制小鼠肝癌模型和人肝癌裸鼠移植瘤模型的癌细胞生长，抑制率达38.0%。龙葵正丁醇提取物对肝癌SMMC-7721细胞有明显的生长抑制作用，并呈剂量依赖性；经龙葵正丁醇提取物作用后，SMMC-7721细胞出现核固缩和凋亡小体等形态学特征，SMMC-7721细胞周期显著改变，并出现G2/M期阻滞，胱天蛋白酶-3（caspase-3）的表达升高，提示龙葵正丁醇提取物能通过上调caspase-3的表达，改变细胞周期，从而诱导SMMC-7721细胞凋亡。
本课题组曾进行过多种清热解毒类中药抗肝癌细胞增殖作用的研究，单味药如白花蛇舌草、田基黄、两面针等，复方如解毒消癥饮（由白花蛇舌草、夏枯草、山慈菇和苦参组成）、片仔癀等，均表明上述清热解毒类中药从JAK1/STAT3、CDK2-E2F1等不同通路阻滞细胞周期进程或抑制细胞增殖。
三、清热解毒类中药诱导细胞凋亡
1.肿瘤细胞凋亡机制 多细胞生物通过细胞增殖和凋亡来维持自身稳定，若二者之间的动态平衡失调，则可导致细胞恶性增殖，促使肿瘤的发生，而诱导肿瘤细胞的凋亡能有效控制肿瘤的发生、发展。已有证据表明，细胞凋亡受阻可能是肿瘤发病机制之一。细胞凋亡是一种在基因控制下的细胞主动死亡过程，是一系列生化级联反应的结果，以形态和生化上出现一定的改变为特征。细胞凋亡最突出的特点是细胞的凋亡起始于细胞核的改变，表现为核染色质的浓缩致密，DNA分子被特异性Ca2+/Mg2+依赖的DNA内切酶在核小体之间切断，随后细胞膜表面突起与细胞主体分离，形成多个大小不等的有膜包裹着的凋亡小体，内含形态保存完好的细胞器和（或）浓缩的细胞核碎片。凋亡晚期，凋亡细胞和凋亡小体迅速被巨噬细胞或邻近的其他细胞吞噬消化。细胞有增殖、分化和凋亡三方面的特征，在维持正常组织的生长平衡过程中，细胞增殖、分化、凋亡三者相互协调，共同调节。如果细胞凋亡受抑，细胞增殖与凋亡的平衡则被破坏，细胞死亡率下降，一旦机体不能重新恢复这种平衡，将导致细胞数目不断增加，表现出生长优势，这是肿瘤形成的一个重要基础。较多资料表明，在肿瘤发生过程中，Bcl-2、c-Myc和ras基因可协同转化并使细胞永生化。另外，本属程序性死亡的细胞如未按时凋亡，这种“老化”细胞的染色体则会不稳定，基因易突变，对致癌物的易感性升高，从而增加了恶变概率。抑癌基因p53的缺失使细胞凋亡大大减少，自发肿瘤发生率上升。因此，肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，也是细胞凋亡异常的疾病。
凋亡不同于坏死，它是由一些生理信号启动的，这些生理信号是通过信号传导途径引起细胞内相关基因表达改变而起作用。细胞凋亡主要有2条信号传导通路：线粒体依赖性途径和死亡受体途径。传统细胞超微结构分析认为，线粒体形态在细胞凋亡过程中一直维持不变，其在细胞凋亡中的作用往往被忽略。可近年实验研究显示，线粒体在细胞凋亡中发挥着关键作用。某些与凋亡相关的基因产物（蛋白质和酶），均可定位于细胞线粒体，而线粒体跨膜电位崩解是细胞凋亡早期特异性指标之一。这是由PT孔开放引起线粒体通透性转换的直接结果。PT孔是跨越线粒体内外膜的通道，主要是由位于线粒体内膜的腺核苷酸转位子（TNT）和位于外膜的电压依赖性离子通道（VDAC）所组成。许多研究表明，PT孔开放可引起一系列与细胞凋亡相关的事件发生，如在线粒体跨膜电位崩解时，线粒体可释放1种50kDa的蛋白质，并以此蛋白质直接诱导细胞核凋亡而不需任何辅助因子。线粒体释放蛋白，包括细胞色素C（cyt-C），进入细胞质后可在ATP或dATP协同作用下，与凋亡蛋白酶活化因子-l（Apaf-l）结合以使其分子变构，激活caspase-9，进而激活caspase-1等酶系，以导致细胞凋亡。另有研究发现，某些凋亡因子也可通过破坏的线粒体外膜直接进入细胞质造成细胞凋亡。细胞在凋亡过程中需要能量供应，有无能量的供应可能是细胞进入凋亡还是坏死过程最主要的生化机制上的差别。因此，线粒体作为提供能量的细胞器，在细胞凋亡中至关重要。死亡受体属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，可传导由特定的死亡配体引起的凋亡信号。至少有5种死亡受体在细胞凋亡信号传导中发挥作用，其中最典型的死亡受体是Fas（又称Apo-1或CD95）。它是1种膜受体形式，广泛分布于多种类型细胞（尤其是淋巴系统来源的肿瘤细胞）表面。Fas可被抗Fas活化型抗体或Fas配体（FasL）活化，通过一系列信号蛋白中介，启动caspase级联切割程序，导致细胞凋亡发生。Fas/FasL介导的细胞凋亡在肿瘤的发生发展中有重要作用。Fas表达于肿瘤细胞表面，其配体FasL在被激活的T细胞上表达，一旦Fas分子膜外基因接受FasL的刺激，即可通过多种途径将信号传递给肿瘤细胞内的凋亡基因，导致DNA降解，肿瘤细胞发生凋亡。FasL激活Fas的机制尚不清楚，可能与通过细胞内Ca2+信号系统传递死亡信息、激活caspase 3或激活相应的蛋白激酶有关。
参加肿瘤细胞凋亡调控的基因有正负调控因子2类，主要是由以caspase家族为代表的凋亡活化基因和以Bcl-2家族为代表的凋亡抑制基因共同控制。Bcl-2基因家族中基因众多，有些属抑凋亡基因，如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W、Mcl-1等，有些属促凋亡基因，如Bax、Bcl-Xs、Bak等。Bcl-2基因家族位于线粒体外膜，对细胞凋亡的调控作用是通过线粒体依赖性途径而实现的。Bcl-2被首先发现于人B淋巴细胞瘤。在许多胚胎组织中，Bcl-2基因广泛存在，而在成熟的或走向凋亡的细胞中不表达或低表达。Bcl-2被认为是特异性抑制细胞凋亡的存活基因。许多实验也证实，Bcl-2是肿瘤细胞凋亡的抑制物，可以保护肿瘤细胞免受各种诱导剂诱发的凋亡，但不影响肿瘤细胞增殖。在凋亡的肿瘤细胞中，Bcl-2 mRNA的表达水平下降。Bcl-2抑制凋亡的机理可能为：①通过与PT孔蛋白分子相互作用的方式来调节PT孔的开放，从而发挥其抑制细胞凋亡的功能；②Bcl-2可直接与胞浆中caspase-9联结的Apaf-l相结合而存在于线粒体外膜，通过形成线粒体-Bcl-2-Apaf-l-caspase-9的四聚体复合物的形式对Apaf-l的结构进行调控，使Apaf-l失去对caspase酶系的活化能力而抑制细胞凋亡；③Bcl-2和Bcl-xL可作用于cyt-C的下游以抑制caspase活化，从而抑制细胞凋亡；④降低细胞内Ca2+浓度。然而，有学者认为Bcl-2在细胞凋亡中起着双重性的作用。最近实验证实，Bcl-2和Bcl-X的N端结构域可被caspese切割而促进细胞凋亡。Bcl-2表达改变对细胞凋亡起调控作用，与肿瘤的发生密切相关，而且可影响肿瘤的恶性行为（浸润、转移、异常生长），呈组织差异性。
p53基因有2种，分别是野生型p53（Wtp53）和突变型p53。2种基因均参与细胞凋亡，但两者作用不同，Wtp53产物犹如细胞内监视DNA完整的“分子警察”，一旦DNA受损，Wtp53表达迅速增加，使细胞停滞在G1/S期，修复受损的DNA后，使细胞重新进入细胞增殖周期，若DNA损伤过于严重而无法修复，Wtp53则可激活那些诱导凋亡的基因转录，使细胞凋亡。若Wtp53发生突变或缺失，则不能识别和修复DNA损伤，细胞带着受损的DNA进入S期分裂增殖，导致细胞因遗传不稳定性产生突变和染色体畸变，最终癌变。研究发现，Wtp53在调节Bcl-2依赖的细胞凋亡/生存通路中发挥重要作用，p53直接下调Bcl-2基因表达，在基因转录水平，p53能激活Bax基因的表达。另外，Wtp53能增强促凋亡基因Fas的表达。这些可能是其诱导凋亡的主要机制。Wtp53促进细胞的凋亡，而突变型p53对细胞凋亡有抑制作用。突变型p53基因抑制细胞凋亡的作用与Bcl-2抑制凋亡的作用相似。但并非所有细胞凋亡过程都有p53参与，糖皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡就是非p53依赖性的。
caspase是一种凋亡活化基因，该家族有至少14种成员，其中，至少2/3的成员与细胞凋亡相关，并参与与凋亡相关的机体生理性或病理性过程。caspase家族属于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，转录合成后以酶原形式存在于胞浆中，酶原蛋白N端的原结构域对维持酶的无活性状态及凋亡信号的传导至关重要。尽管各种凋亡信号可刺激细胞内多种信号传导途径，但最终汇集为caspase蛋白酶级联放大反应这一共同通路。不同凋亡信号的刺激可激活多种caspase，而活化的caspase的作用又可随酶底物的性质和酶切位点的不同而产生多种生物学效应。活化的caspase在酶切ICAD/DFF45后，使ICAD/DFF45与CAD解离，活化的CAD使DNA降解；caspase还可酶切凋亡抑制蛋白Bcl-2，使其失去抑制细胞凋亡的生物活性而促进细胞凋亡。caspase酶系还可直接裂解细胞组分或裂解细胞骨架调节蛋白导致细胞凋亡。但也有研究证实，caspase基因家族并不是细胞凋亡的唯一途径，细胞内还存在非caspase依赖性凋亡通路。
肝癌细胞存在高速的细胞增殖率和自然的细胞凋亡率，两者共同决定肿瘤细胞的生长速度。研究人员通过非基因毒致癌剂NAF观察正常肝→突变增生→结节→肝腺瘤→肝癌的突变过程，发现凋亡活性呈逐渐增强趋势，但每一阶段的细胞增殖率均高于凋亡率，因此，癌前肝细胞可获得优先净增长。从起始阶段到癌前病变，促发阶段到肿瘤形成，各期抑制细胞凋亡与加速肿瘤细胞增长的比例虽有不同，但总体上形成复制大于凋亡的趋势。但TGFp及免疫细胞因子可诱导肝癌细胞凋亡而抑制其复制。研究者采用原位末端转移标记法检测20例胆管上皮癌及17例肝癌，细胞凋亡率达10%。目前研究者认为肝癌细胞凋亡与下列因素有关：肿瘤组织固有的代谢过程，肿瘤组织的乏氧状态，肿瘤坏死因子α，细胞毒性T细胞的攻击作用，核酸内切酶的活化。肝癌细胞的凋亡源包括细胞因子，如TNF、IL-2、IL-4，和针对Fas抗原的抗体，在体外可诱导肝癌细胞的凋亡。转化生长因子1（TGF1）促进肝癌细胞DNA降解，并通过受体杀伤细胞促进凋亡。IGFBP-3可能通过直接途径与细胞膜受体结合而诱导肝癌细胞凋亡，对抗胰岛素样生长因子（IGF）对肝癌细胞的增殖作用。外源性化学物质诱导凋亡包括多种非基因毒致癌剂，如苯亚甲基抗坏血酸钠、降脂奈、锌盐、乙醇等可经不同途径诱导肝癌细胞凋亡，硝酸铅、胡萝卜素等可通过凋亡机制影响早期肝癌的形成，化疗药物顺铂、丝裂霉素、维苯甲酸等能引起肝癌细胞的广泛凋亡。通过放疗诱导肝胆肿瘤细胞凋亡可达到杀伤癌细胞的作用，高热微波可引起对其敏感的肝癌细胞凋亡。
2.清热解毒类中药诱导肝癌细胞凋亡 中药也可有效引起肝癌细胞凋亡。苦参碱为豆科植物苦参的有效成分，其基本结构为苦参次碱-15酮，具有抗炎、抗氧化、免疫抑制及抗肿瘤等作用。研究发现，苦参碱能诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡。在苦参碱浓度为1.0g/L时，作用48小时的凋亡率为29.6%~32.8%，该机制与下调stat3、stat5基因表达、抑制JAK-STAT细胞信号转导通路有关。0.5g/L苦参碱干预HepG2细胞48小时后，凋亡率约为22%。而1.0g/L苦参碱作用Bel-7402细胞48小时后，凋亡率仅为18.01%。进一步的研究表明，其作用可能是通过调节细胞内Bax和Bcl-2蛋白的表达，经线粒体信号传导途径实现的，机制可能与苦参碱能将肝癌细胞周期阻滞在G0/G1期有关。白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草的全草，味甘、淡，性凉，内含多种类型的化学成分，主要为蒽醌、萜类、多糖、微量元素和甾醇及其苷类化合物，具有清热利湿、解毒抗癌之功效。研究表明，100mg/L白花蛇舌草乙醇提取物对SMMC-7721细胞的增殖抑制率达到39.40%，有效靶基因达20条，可能是其多途径抗肿瘤所致。白花蛇舌草提取物也可抑制人肝癌Bel-7402细胞的生长，诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖性，其机制可能与激活抑癌基因p53、抑制原癌基因Bcl-xL表达、直接影响肿瘤细胞能量代谢有关。亦有研究显示，白花蛇舌草在剂量为50mg/kg时对小鼠皮下移植瘤（H22）的抑瘤率可达48.6%。半枝莲又名狭叶韩信草，为唇形科黄芩属植物半枝莲的干燥全草，味辛、苦，性寒，具有清热解毒、活血化瘀、消肿止痛等功效。半枝莲提取物对肝癌细胞的凋亡率为24.03%~36.33%。研究表明，其诱导H22细胞凋亡的机制可能与降低肿瘤细胞线粒体膜电位有关。而对于诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡，研究显示其能够上调caspase-3表达，下调Bcl-2和存活蛋白（survivin）的表达。另外，半枝莲提取物还可诱导HepG2及QGY-7701等细胞发生凋亡。鸦胆子是苦木科植物鸦胆子的成熟果实，其醇提取物即鸦胆子油乳。油乳主要成分为油酸和亚油酸，具有抗肿瘤及增强机体免疫功能的作用。鸦胆子油乳对肝癌细胞的抑制率约为20%~30%，可将细胞阻滞于G0/G1期，其诱导凋亡的作用与抑制p53和Bcl-2的表达密切相关，其中，p53途径起主导作用。青蒿素是在青蒿叶中分离出的有效抗疟成分，具有过氧基团的倍半萜内酯。近年研究发现，青蒿素及其衍生物包括青蒿琥酯等均对肿瘤细胞有明显的杀伤作用。100mg/L青蒿琥酯对肝癌细胞的抑制率约为16%，凋亡率不超过12%。其分子机制是非p53依赖性的，与凋亡调节基因Bcl-2下调有关。
本课题组进行了白花蛇舌草、粗叶悬钩子、解毒消癥饮、地耳草、熊胆粉、蒲葵子、田基黄、复方白花蛇舌草等药物诱导肝癌细胞凋亡的研究。结果表明，上述药物可通过线粒体凋亡通路或Hedgehog通路诱导肝癌细胞发生凋亡。
四、清热解毒类中药抑制血管新生
1.肝癌血管新生的意义 血管新生是指原有的毛细血管或后毛细血管静脉新生的过程。1971年，Forlkman首次证实，实体瘤在缺乏血管新生的条件下仅能生长至直径2~3cm。随后的研究又发现，肿瘤的生长有赖于血管新生。肿瘤组织中的新生血管不仅为瘤体提供氧及营养物质，而且为肿瘤转移及血管浸润提供通道，故血管新生与肿瘤生长、转移密切相关。肿瘤组织生长的初期并没有血管新生现象，随后在肿瘤基因的调控下启动血管新生过程，而且该过程一旦启动即难以自行限制，此时肿瘤细胞将分泌多种血管新生因子以促进血管形成。但肿瘤组织的大量新生血管并非肿瘤细胞分泌物的单一作用结果。毛细血管内皮细胞、炎性细胞、巨噬细胞及成纤维细胞等均可分泌血管增殖或抑制因子。在生理情况下，血管增殖与抑制因子处于平衡状态，以维持正常代谢功能，但在肿瘤组织中，这一平衡被过量分泌的血管增殖因子所打乱，造成大量新生血管的形成。血管内皮生长因子（VEGF）是最早被分离出来的一种促血管形成多肽，被认为是最强的血管形成促进因子。在促使内皮细胞增生的同时，VEGF还可增加血管通透性，促进肿瘤分泌物的血管外渗透及细胞外基质合成，以利于血管内皮附着及生长。肿瘤组织生长到一定大小时，其原有的血管氧供不足，造成细胞缺氧，刺激肿瘤细胞开始合成、分泌VEGF。同时，ras等肿瘤基因或p53等抑癌基因亦参与对VEGF的调控，这2类基因可分别促进或抑制VEGF的分泌。VEGF与内皮细胞表面特异性受体VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR/Flk-1）结合，经由Akt/PI3/MAPK等信号通路，促进内皮细胞的增殖、迁移和侵袭，发挥相应的生物学功能。当外源VEGF重组蛋白作用于肝癌细胞系时，该重组蛋白能够刺激肿瘤细胞增殖，提示肝癌细胞也有VEGFR表达，存在VEGF/VEGFR自分泌环。采用siRNA技术研究VEGF对体外内皮细胞功能和体内肝癌肿瘤生长、血管生成的影响，结果显示，敲除VEGF基因可以降低内皮细胞体外增殖和血管形成的能力，并在体内使肿瘤生长减缓，微血管密度降低，表明VEGF在肝癌血管生成过程中起着至关重要的作用。有研究表明，VEGF、Flk-1和HIF-1α参与了肝硬化退变结节向肝癌的恶性转化，VEGF相关的Flk-1和HIF-1α表达增加可能与肝血窦毛细血管化和相应区域的不配对动脉（即没有胆管伴随的动脉，提示为新生血管）数量增加有关。
表皮生长因子（EGF）家族包括6种配体，分别是EGF、转化生长因子-α（TGF-α）、双调蛋白（amphiregulin）、β细胞素（BTC）、肝素连接的EGF样生长因子和表皮调节素（epiregulin），以及4种受体ErbB1（HER1）、ErbB2（HER2）、ErbB3（HER3）和ErbB4（HER4）。EGF、EGFR在肝癌中过表达，与肝癌的发生、发展有密切关系，在肝癌的血管新生过程中也发挥了功效。与正常肝组织相比，肿瘤组织中BTC和EGFR表达分别上调80%和60%，且肿瘤细胞分泌的BTC与肝血窦内皮细胞上表达的EGFR密切相关，提示BTC和EGFR通过旁分泌途径来促进血管生成。最新研究发现，肝细胞生长因子（HGF）Kringle-1结构域的抗血管新生及抗肿瘤作用主要是经EGF/EGFR通路实现的。血小板衍生生长因子（PDGF）是成纤维细胞、平滑肌细胞及其他间质来源细胞的强丝裂原和化学驱动剂。生物活性的PDGF分子一般由二硫键连接的同源二聚体或异源二聚体组成，受体为PDGF-α、PDGF-β，属于酪氨酸激酶受体。PDGF家族成员目前至少有4个，即PDGF-A~D，其中，后两者是近年来刚发现的成员。在PDGF-C的转基因小鼠中发现PDGF-C过表达可导致肝纤维化，随后出现癌前病变及新生血管，最终恶化为肝癌。另有报道显示，动员的骨髓来源内皮祖细胞（EPC）也参与了肝癌的肿瘤血管新生过程，而该EPC的动员与血浆中的PDGF-B和VEGF165有关联。在成纤维细胞生长因子（FGF）家族中，以碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对血管增生的作用最为明显。与VEGF相同，bFGF可由肿瘤及内皮细胞分泌，并与VEGF协同促进血管形成。肿瘤细胞合成的bFGF可增加内皮细胞的有丝分裂，进而促进内皮细胞自主分泌bFGF。此外，血小板分泌的内皮细胞生长因子（platelet-derived endothelial cell growth factor，PD-ECGF）及转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）亦可促进bFGF的分泌。TGF-β1由血小板及巨噬细胞所分泌，其作用效果取决于浓度的高低，浓度低时表现为促进血管形成，而浓度高时则抑制血管形成。
表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）是促有丝分裂因子，在促使正常细胞与肿瘤细胞增生的同时，亦有促血管形成的作用。血管生成素1和2（angiopoietin 1、2，Ang-1、Ang-2）是新近发现的血管增殖促进因子，为内皮细胞表面受体的配体，用以调节内皮细胞与周围细胞的相互作用及促进内皮细胞的成熟。血管生成素家族已有Ang-1~4，均为酪氨酸激酶受体Tie-2的配体。目前，人们较多地关注Ang-1和Ang2，二者对Tie-2有相同的亲和力，却发挥着完全不同的作用。Ang-1向内皮细胞提供生存信号，募集周细胞和平滑肌细胞，促使形成稳定的血管；Ang-2作为Ang-1的拮抗剂，在VEGF存在时，使周细胞从内皮脱离，引起血管膨胀、泄露，导致蛋白酶和基质成分外渗。肿瘤组织中的Ang-2水平与肝癌患者的微血管密度、临床病理参数密切相关，其中，Ang-2/Ang-1提示了肿瘤血管发生的状态；在VEGF存在的条件下，Ang-2高表达能够诱发早期的血管新生，并且Ang-2在非癌组织恶性转化过程中发挥了重要作用。肝静脉Ang-2水平与肝癌组织中Ang-2 mRNA表达和微血管密度密切相关。研究者将Ang-2与临床病理特征相比对时发现，高水平的Ang-2与门静脉侵袭有显著关联。
整合素（integrin）家族是介导细胞与细胞外基质相互作用的最主要的分子，大多为亲异性（两相邻细胞表面的不同种细胞黏附分子间的相互识别与结合）细胞黏附分子，其作用依赖于Ca2+。整合素可以识别、结合细胞外基质中相应的配体，为细胞黏附提供附着点，同时调整细胞骨架结构，调节蛋白的磷酸化水平和基因表达，从而调控细胞的运动、增殖和凋亡。高转移肝癌细胞株KYN-2的散播是通过integrin-MEK-ERK信号级联反应来调节的，提示了integrin在肝癌肝内转移中的重要作用。转染了α3-integrin的HepG2细胞对层粘连蛋白-5（laminin-5）诱导的黏附、迁移和侵袭能力显著增强，表明肝癌细胞中integrin高表达与血管生成过程密切相关，并直接参与了细胞的恶性表型转化。选择素（selectin）属亲异性细胞黏附分子，其作用依赖于Ca2+，主要参与白细胞与内皮细胞之间的识别与黏附。已知选择素有3种：L-选择素、E-选择素和P选择素。有研究表明，肝癌HepG2细胞与内皮E-选择素的相互作用无一例外地经由唾液酸化酶X（Sialyl-Lewis X，sLeX）寡糖来完成，而α-1，2-岩藻糖（FUT1）可以抑制sLeX合成，从而阻断已活化内皮细胞的黏附作用。研究者们使用转导FUT1的HepG2细胞建立裸鼠移植瘤模型，发现与对照组相比，FUT1显著抑制了肿瘤的生长及血管新生，表明肝癌血管新生依赖于由E-选择素介导的肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用。免疫球蛋白超家族包括分子结构中含有免疫球蛋白样结构域的所有分子，一般不依赖于Ca2+。除免疫球蛋白外，还包括T细胞受体、B细胞受体及主要组织相容性复合体等。有的属于亲同性（两相邻细胞表面的同种CAM分子间的相互识别与结合），有的属于亲异性。HAb18G/CD147是该家族中高度糖基化的跨膜蛋白。最新的报道显示，活化的HUVECs中HAb18G/CD147表达上调，经由PI3K/Akt通路促进血管新生，且在三维细胞共培养模型中，增加MMP的表达，对肝癌的黏附、侵袭和转移都有重要作用，已成为肿瘤治疗的新靶点。钙黏蛋白（cadherin）属亲同性细胞黏附分子，其作用依赖于Ca2+。研究人员至今已鉴定出30种以上的钙黏蛋白，分布于不同的组织。上皮钙黏蛋白（E-CD）是钙黏蛋白家族的1个成员，在体内和体外均被证明能够抑制侵袭。最新研究发现，E-CD可能在再生肝磷酸酶-3（PRL-3）促进肝癌血管生成及侵袭的过程中发挥作用。integrin-matrix黏附系统和E-cadherin/catenin黏附复合物经由黏着斑激酶、细胞外信号调节激酶及β-catenin/wnt通路，共同介导肝癌细胞和细胞外基质的相互作用。T钙黏蛋白（T-cadherin）是另一个非典型的钙黏蛋白家族成员，在肝癌中也表现出肿瘤抑制效应，增强的T-cadherin表达引起G2/M细胞周期停滞，抑制细胞增殖，提高细胞对TNF-α诱导的凋亡的敏感性，T-cadherin在肿瘤内毛细血管的内皮细胞有表达，可能通过与bFGF/adiponectin信号通路的相互作用参与了肝癌血管生成过程。
趋化因子（chemokines）和其他多种血管生成因子组成网络，共同参与血管生成的调控。根据蛋白质中前2个半胱氨酸残基相对位置的不同，此类因子可分为4类：CXC（α趋化因子）、CC（β趋化因子）、C（γ趋化因子）和CX3C（δ趋化因子），其中，CXC又可以根据其第1个半胱氨酸前是否具有ELR序列而分为ELR+和ELR-2类。趋化因子受体也可相应地分为CXCR、CCR、CR和CX3CR，均为G蛋白偶联受体（GPCR）家族成员。肿瘤细胞和肿瘤间质细胞（包括内皮细胞和趋化因子介导浸润的巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞和NK细胞等）都可分泌趋化因子，也都有趋化因子受体表达。不同的趋化因子对血管生成的作用存在差异。一般说来，ELR+的CXC类趋化因子具有促进肿瘤血管生成的作用，其中，以CXCL8（IL-8）为代表。血小板反应素（thrombospondin）是血管新生抑制因子，由血管内皮细胞、成纤维细胞、单核巨噬细胞所分泌，肿瘤细胞增殖时可抑制其合成、分泌。血管抑素（angiostatin）和内皮抑素（endostatin）是近年新发现的血管抑制因子。血管抑素为纤维蛋白溶酶原的裂解产物，而内皮抑素则是胶原ⅩⅧ的裂解物，二者均有抑制肿瘤细胞向远处转移的作用。
肝癌是血管富集的肿瘤，血管新生在肿瘤的发生发展过程中起着举足轻重的作用。首先，由于生长速度快，癌细胞需要血管不断运送养料和氧气来维持其生存，并排出代谢废物；其次，由于新生血管的基底膜不完善，癌细胞易于透过血管进入循环系统，从而形成远端转移。因此，干扰肿瘤与其微环境的相互作用进而阻断肿瘤血管新生，可为肝癌的治疗提供新的希望。HCC是肝癌3种类型中最常见的1种，占80%左右。HCC的血管新生起始于癌前病变向HCC的转化阶段，并随肿瘤的发展而发展。同其他实体瘤一样，HCC的血管生成过程也基于内皮细胞被激活继而增殖、迁移的基本规律。在肿瘤细胞分泌的促血管生成因子的刺激下，邻近血管处于静息状态的内皮细胞被激活，活化的内皮细胞分泌蛋白酶，使内皮细胞连接松弛，基底膜和细胞外基质降解，于是，基质中包含的各种促血管生成因子被释放，继续刺激内皮细胞，使其侵入周围组织，并增殖、迁移，最终形成管腔结构。基底膜和细胞外基质重塑，周围支持细胞被募集，使新生血管稳定并且成熟。
HCC中血管的改变主要涉及动脉化和肝血窦毛细血管化。正常肝组织的血供来自门静脉和肝动脉。由于HCC的高代谢性，肿瘤组织则主要由动脉系统供养。动脉的过度形成可以作为HCC无创诊断标准的一部分。肝血窦毛细血管化是在HCC中普遍发生的另一血管新生过程。肝血窦是通透性最大的血窦之一，是不连续毛细血管，其内皮细胞扁而薄，有发达的窗孔。正常肝血窦内皮外没有基底膜存在。HCC的肝血窦内皮细胞表型发生改变：肝血窦窗孔减少甚至消失，形成连续的毛细血管，并伴随窦状隙胶原化，内皮细胞和肝细胞附近层粘连蛋白沉积，形成基底膜。肝血窦毛细血管化以CD34表达为特征，而正常肝血窦内皮细胞不表达此标志物。在HCC组织中EGF和FGF表达过度，而正常肝组织则不表达；二者表达的阳性率与患者的病理参数无关。随后的研究证实，EGF仅在HCC中过度表达，而肝转移腺癌却不表达；说明EGF可能仅与HCC的生长有关。据报道，在FGF表达呈阳性的HCC中，其组织中血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）的表达也多呈阳性，反之亦然；由于vWF多在毛细血管化的肝血窦上皮中表达，因此，研究者认为FGF参与了肝癌的血管形成过程。研究还发现，HCC的细胞只表达bFGF而非酸性FGF；bFGF通过自主分泌的途径，促进新生血管形成及肿瘤细胞的分裂、增殖。分子生物学检查证实，在HCC组织中，VEGF的表达与血管造影显示的血管密集度成正相关，说明VEGF对HCC组织的血管增殖至关重要。原位杂交实验表明，VEGF由HCC的细胞合成，其表达量在肿瘤坏死区明显增加，说明组织缺氧为VEGF合成的重要刺激因素。与患者病理参数比较后，研究者发现VEGF与HCC的增殖指数及门静脉癌栓呈正相关，与肿瘤包膜呈负相关；说明VEGF可能与HCC的浸润及转移有关。但在有关VEGF与HCC分化程度、血管浸润及预后关系的报道中，其结果却大相径庭。研究认为，造成这一现象的原因可能与内皮细胞表达VEGF受体有关。VEGF受体有2类：flk-1与flt-1。HCC中VEGF的表达仅与flt-1有关，与flk-1无关。HCC组织中的血管新生除受VEGF的正向调节外，亦受金属弹性硬蛋白酶与血管抑素的负向调节。此外，其他血管增殖促进因子，如血小板衍生内皮细胞生长因子（PD-ECGF）及血管白细胞生成素2，亦参与了HCC的血管增殖调节。
2.清热解毒类中药抑制肝癌血管新生的机制 肿瘤的微血管形成过程，即中医“久病入络”而形成络脉病变的过程。其病机始动因素为正气本虚，癌毒内蕴，日久则正不胜邪，引起脏腑、阴阳、气血功能失调，机体内稳态结构被破坏，所以，中医药防治肿瘤的原则涉及扶正固本、解毒散结及活血化瘀等方面。中药抗肿瘤血管新生机制大致分为如下几类：①下调或抑制肿瘤VEGF等促血管生成因子，上调抑制血管生成因子；②抑制MMP活性，阻止血管内皮基底膜的降解；③抑制内皮细胞向肿瘤组织迁移及在迁移中增殖或小管形成；④对内皮细胞的毒性作用；⑤抑制内皮细胞黏附或直接诱导内皮细胞凋亡。清热解毒类中药和其有效成分（如姜黄素）可抑制内皮细胞增殖周期，抑制细胞微管的形成和破坏已形成的微管，降低53kDa和72kDa金属蛋白酶的明胶降解活性，减少72kDa金属蛋白酶的转录和表达。苦参通过下调MMP-9、MMP-2、磷酸化Akt及VEGF R1的表达，可抑制MDA-MB-231细胞浸润和迁移。长春花协同雷帕霉素，可抑制肝癌的血管新生，抑制内皮细胞bFGF诱导的迁移和管腔形成，在体内实验被发现能够破坏血管。蟾毒灵可阻滞内皮细胞G2/M期，诱导内皮细胞凋亡。蒲公英诱导内皮细胞凋亡，并呈时间和浓度依赖，抑制HepG2细胞中VEGF、MMP-2和MMP-9表达。复方鳖甲煎丸能显著抑制肿瘤细胞分泌VEGF，从而降低荷瘤小鼠肿瘤病灶内的微血管计数，以达到抑制肿瘤生长的目的。
本课题组研究了白花蛇舌草、粗叶悬钩子、蒲葵子、熊胆粉、解毒消癥饮等不同中药抑制肝癌血管新生的机制，结果表明上述中药主要通过抑制VEGF家族相关因子及其受体的表达、抑制MMP家族的蛋白表达起到抑制血管新生的作用。
五、清热解毒类中药逆转多药耐药
1.肿瘤细胞多药耐药分子机制 多药耐药（multiple drug resistance，MDR）是指恶性肿瘤细胞接触一种抗癌药后，继而对其他多种结构不同、作用机制各异的抗癌药产生耐药的现象。耐药性通常代表着肿瘤细胞对毒性损伤和细胞压力的适应状态。化疗初期的MDR被称为原发性耐药，而多次化疗后的MDR被称为获得性耐药。然而，引起MDR的机制比较复杂，主要包括跨膜转运蛋白［如P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）］、MDR相关蛋白（MDR-associate protein，MRP）和肺癌耐药蛋白（lung cancer resistance protein，LRP）等转运蛋白介导的药物外排机制，酶活性提高介导的MDR，凋亡途径相关基因表达下降等多种机制。也有研究表明，许多药物通过多种细胞相关基因和信号通路参与自噬调控，如p53基因、miRNA、PI3K/Akt/mTOR通路、ERK/NF-κB通路、MAPK通路、EGFR通路等，导致肿瘤细胞逃避其杀伤作用，产生MDR。(https://www.daowen.com)
三磷酸腺苷结合盒（ABC）转运蛋白是细胞膜上的跨膜蛋白，具有药泵的作用，能增强化疗药物的外排，其表达程度与耐药程度呈正相关，是引起肿瘤多药耐药的主要原因。ABC转运蛋白主要包括ABCB1（P-gp）、ABCC1（多药耐药相关蛋白MRP1）和ABCG2（乳腺癌耐药蛋白BCRP）。其中，由P-gp介导的耐药是最为常见的。P-gp是由MDR1基因编码的1种跨膜转运蛋白，MDR1基因由2个同源部分组成，每个部分都包含6个疏水跨膜区和1个具有高度保守ATP结合位点的亲水区，亲水区可能含有2个核苷酸结合位点，而疏水区则含有多个与MDR有关的药物结合位点。当疏水亲脂性抗癌药物，如阿霉素、紫杉醇、长春新碱、鬼臼乙叉甙和依托泊苷等，顺浓度梯度到达细胞后，与P-gp结合，导致ATP结合区活化。此时，P-gp核苷酸结合位点与ATP结合，ATP随即水解为ADP，释放能量，在Mg2+作用下使P-gp形态发生变化，在药物尚未发生细胞毒作用时即被转至细胞外，使细胞内药物浓度降低。于是，作用到药物靶位细胞核上的药物浓度相对降低而产生MDR。
P-gp介导的MDR涉及几种信号转导途径和转录因子，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、p38、腺苷单磷酸依赖性蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶C信号通路。克服MDR的有效方法是抑制P-gp的功能或其在癌细胞表面上的表达。MRP1主要位于细胞膜，而在有的细胞中主要位于内质网或高尔基体上。MRP1能识别和转运与谷胱甘肽（glutathione，GSH）偶合的底物，细胞毒药物可与GSH-S-偶合物相结合形成能被MRP1转运的三重复合物，导致细胞内药物积聚的减低或分布改变，有些药物局限于核周囊泡内，而不能进入细胞核内，从而使药物呈房室分布，阻碍了药效作用的发挥。同时，MRP1也是1种ATP依赖泵，能将带负电荷的药物分子逆浓度泵出细胞外，还可通过改变细胞质及细胞器的pH值，使药物到达作用部位的靶位点时浓度减少，从而导致肿瘤细胞耐药。
LRP是1993年Scheper在研究P-gp阴性的人非小细胞肺癌多药耐药细胞株SW1573/2R120时发现的，遂命名为肺癌耐药蛋白，其缺少跨膜转运区域，缺少像MRP和P-gp所特有的ABC转运蛋白的ATP结合位点，通过比较序列分析，LRP与穹隆蛋白高度同源，大多数穹隆蛋白存在于细胞质中，很少的一部分在核膜及核孔复合物上，组成核孔复合物的中心塞，介导细胞质与细胞核中各种物质的转运。LRP主要通过核靶点屏蔽机制引起MDR，它可使那些以细胞核为靶点的药物，如铂类和烷化剂，不能通过核孔进入细胞核。有些药物即使进入了核内也会被很快转运到胞质中，从而产生多药耐药。BCRP识别和运输许多抗癌药物，包括在临床使用中相对较新的常规化学治疗药和靶向分子治疗药。因此，癌细胞中的BCRP通过抗癌药物的主动外排直接引起MDR。MRP耐药机制的产生主要有以下3个方面：①控制药物的内流和外排，降低细胞内药物浓度；②限制药物与靶点结合；③影响细胞内pH值及细胞膜通透性。
谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase，GST）是1组具有多种生理功能的蛋白质超基因家族，其中，GST-π与恶性肿瘤多药耐药关系最密切。GST-π可催化亲电物质与GSH结合，其本身可与亲脂性细胞毒药物结合，增加其水溶性，促进代谢，最终将毒性物质从尿液排出或降解为无毒性的醇类物质，从而降低抗肿瘤药物的细胞毒作用；还可清除蒽环类药物等产生的自由基，减轻自由基对细胞的损伤，导致耐药。新近研究报道显示，GSH及其合成酶γ-GCS、GST-π与MRP1一同构成了连续的系统：γ-GCS作为GSH合成的限速酶，其表达水平的升高必将导致细胞内GSH含量的增多；GSH可以与抗肿瘤药物结合，降低药物的毒性，增加药物的水溶性；GST-π催化药物与GSH的结合，细胞内GST-π水平升高和（或）活性增强可大大增加细胞对药物的解毒功能；MRP1又可将药物与GSH的偶合物主动排出细胞外，完成细胞发生MDR的过程。
DNA拓扑异构酶是包括拓扑异构酶抑制剂在内的多种抗肿瘤药物的重要靶点，表达的下调或性质改变都会降低化疗药物的敏感性。在哺乳动物细胞中有2种形式的拓扑异构酶存在：TopoⅠ、TopoⅡ。TopoⅡ比TopoⅠ的生理意义更为重要，很多抗癌药物是它的抑制物。TopoⅡ基因的突变可能与细胞株表达MDR有关。实验研究表明，药物和P-gp、修饰物结合，能够诱导产生由TopoⅡ导致的MDR。
核因子NF-κB可以控制癌症的多种细胞过程，包括炎症、转化、增殖、血管生成、侵袭、转移、化疗耐药和放射抵抗等。适度地抑制NF-κB的活性，可控制肿瘤细胞MDR的产生。Bcl-2基因是目前公认的抗凋亡原癌基因，它可阻断多种原因导致的细胞凋亡过程，并促进肿瘤细胞增殖。而Bax基因作为Bcl-2基因家族中的一员，其表达产物可与Bcl-2蛋白形成异源二聚体，从而抑制Bcl-2的抗凋亡作用。因此，抑制Bcl-2基因的表达可以逆转肿瘤MDR。
生存素（survivin）是凋亡抑制蛋白家族的一员，具有抑制细胞凋亡与调节细胞周期的功能。survivin所具备的强大凋亡抑制作用与肿瘤细胞的MDR有关，survivin主要通过2条途径来阻断细胞凋亡：直接抑制caspase-3和caspase-7的活性，survivin与周期蛋白激酶CDK4和CDK2相互作用。所以，抑制survivin基因表达是逆转肿瘤MDR的有效途径之一。
自噬是指细胞通过形成自噬溶酶体降解细胞质中受损的细胞器及蛋白质，并循环利用代谢产物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新，具有维持细胞内环境稳定及机体平衡的重要意义。在肿瘤细胞中，自噬具有双重作用：在癌前阶段，自噬激活可清除受损的蛋白质和包括线粒体在内的细胞器，有抑癌作用；在转移性肿瘤中，自噬常给肿瘤细胞提供能量和营养成分，起促瘤作用。自噬在肿瘤细胞的耐药性发展中起着至关重要的作用，PI3K/Akt/mTOR是调控细胞自噬的核心通路，阻断该通路可改善肿瘤耐药现象已得到证实。miR-101可以抑制肝癌细胞的自噬作用，从而增强顺铂诱导肝癌细胞凋亡的能力，提高化疗效果。细胞自噬参与了肝癌细胞的5-Fu耐药过程，用自噬抑制剂3-甲基腺苷抑制细胞自噬后，肝癌细胞对5-Fu的敏感性增加，可以部分逆转耐药现象。
肿瘤微环境指肿瘤细胞产生和生活的内环境，是一个动态网络。微环境的改变与肿瘤的发展和转移密不可分。肿瘤相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤微环境的重要组成部分，CAF可以通过间质转化（EMT）赋予癌细胞类似肿瘤干细胞的多能性，并通过直接的相互作用导致肿瘤耐药性。此外，微环境缺氧可以诱发核转录因子缺氧诱导因子-1（hypoxia induced factor-1，HIF-1α）通过ERK/MAPK通路上调MDR相关基因的转录和相应蛋白的合成，参与肝癌MDR的形成。
2.清热解毒类中药逆转多药耐药的机制 柴胡具有明显的逆转肝细胞癌Bel-7402细胞株MDR的作用，其部分机制是抑制Bel-7402细胞的MDR1 mRNA表达，提升TopoⅡα的mRNA水平。板蓝根高级不饱和脂肪酸在非细胞毒剂量时能逆转BEL27404/ADM对ADM的耐药性，其逆转作用可能与降低P-gp药物外排功能、增加细胞内药物浓度有关。白花蛇舌草乙醇提取物（EEHDW）能显著下调细胞中ABCC1/MRP1、ABCB1/P-gp、ABCG2/BCRP、Cyclin D1、CDK4、Bcl-2的mRNA和蛋白表达，上调p21、Bax的mRNA和蛋白表达，呈剂量依赖性；抑制ERK1/2、JNK、p38等信号转导通路活化过程；能上调HCT-8/5-FU细胞中miR-92b、miR-1247、miR-4800-5p、miR1224、miR-1260、miR-4669、miR4298的表达，抑制miR-582-5p、miR-4454、miR222、miR-483-5p、miR-4443的表达。苦参碱是从中药苦参的干燥根中提取的一类生物碱，可通过降低TopoⅡ酶活性、抑制MDR1/P-gp的表达等多种途径综合干预肿瘤MDR的发生，从而逆转肿瘤MDR现象。
六、清热解毒类中药对放化疗增效减毒
放化疗是目前肝癌的综合治疗手段之一，临床上应用广泛。但放化疗具有多种毒副作用，由此而限制治疗剂量，又影响治疗效果。
放疗会引起全身反应和局部反应，全身反应有头晕乏力、食欲下降、恶心呕吐、白细胞减少等；局部反应则主要表现为口干咽痛、口咽溃烂、吞咽困难、咳嗽气短、恶心呕吐、腹痛腹泻等。这些毒副作用限制了放射剂量及疗程，因而影响了放疗效果。中药对肝癌放疗的增效减毒作用包括诱导肿瘤细胞凋亡和调整细胞周期分布，如白花蛇舌草水提液可能是通过下调人肝癌HepG2细胞CDK2、ERF1 mRNA的表达将肿瘤细胞阻滞于G0/G1期，进而抑制其增殖；改善肿瘤细胞乏氧状态，如半枝莲抗癌作用可能与其乙醇提取液中黄酮类化合物的抗氧化活性有关；抑制肿瘤血管生成，如石见穿提取物对肝癌H22小鼠移植性肿瘤的生长具有抑制作用，这种作用可能是通过下调肿瘤组织中VEGF表达和MVD来阻断肿瘤血管生成；莪术提取物β-榄香烯和放疗协同，抑制VEGF表达，改善肿瘤血管形成情况，增强了肿瘤细胞的放射敏感性。
化疗中常见的毒副作用有：①消化道症状，如食欲不振、恶心、呕吐、腹泻、便秘等；②骨髓抑制，如白细胞减少、血小板减少、贫血等；③全身反应，如疲乏无力、精神萎靡、心慌气短、失眠自汗、咽干舌燥、脱发、过敏等；④脏器功能减退，如肝肾功能异常、心肌损害、免疫器官功能衰减等。清热解毒类中药对肝癌化疗具有增敏作用，如叶下珠复方Ⅱ号对H22荷瘤小鼠化疗的增效减毒作用。根据实验结果，叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量与环磷酰胺合用后，抑瘤率分别为74.3%和66.9%，均大于两药合用的理论相加效应值72.2%和64.8%，证实叶下珠复方Ⅱ号对肝癌H22荷瘤小鼠的化疗具有增效作用。清热解毒类中药对肝癌化疗骨髓抑制具有缓解作用，如艾迪滴丸对荷瘤小鼠化疗后的增效减毒作用。研究发现，艾迪滴丸对环磷酰胺化疗小鼠所引起外周血白细胞数和骨髓有核细胞数下降有明显的改善作用。小金丹对5-Fu具有减毒增效作用，研究人员采用白细胞计数方法计数模型小鼠的白细胞（WBC）、血红蛋白（Hb）、血小板（PLT）及骨髓有核细胞，结果发现5-Fu加小金丹组与5-Fu组相比，WBC计数、Hb含量、PLT计数和骨髓有核细胞计数差异有统计学意义。清热解毒类中药对肝癌化疗免疫抑制具有防治作用，如半枝莲多糖对化疗药物CTX的增效减毒作用。有研究证实，半枝莲多糖可提高单核巨噬细胞功能和IL-2、TNF-α的活性，认为半枝莲多糖对化疗药物环磷酰胺具有明显的增效减毒作用，可能是通过增强机体的免疫功能而实现的。
本课题组进行了解毒消癥饮对5-FU的增效减毒作用研究，发现解毒消癥饮可增强5-FU对肝癌细胞的细胞毒性，具有一定的协同作用，亦可减轻5-FU的药物毒副作用。
七、清热解毒类中药抑制肿瘤侵袭与转移
1.肝癌侵袭转移的分子机制 肿瘤侵袭和转移，是肿瘤细胞从原发肿瘤脱离后向周围和（或）远处组织转移的过程，涉及肿瘤细胞穿过细胞外基质（extracellular matrix，ECM）屏障、血管壁的基底膜（basement membrane，BM）及穿出血管壁进入宿主微环境等环节，可分为3步，黏附、降解、移动。
肿瘤侵袭转移的首要步骤是肿瘤细胞与ECM中的层粘连蛋白（laminin，LN）和纤维连接蛋白（fibronectin，FN）相黏附。肝癌细胞的黏附力是由细胞膜表面的黏附分子所决定的，其高黏附特性与其高转移特性有关。黏附分子包括选择素家族、整合素家族、免疫球蛋白超家族、钙黏素家族。细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1）又称CD54，是免疫球蛋白超家族的单链跨膜球蛋白，它的配体是白细胞功能相关抗原-1（LFA-1）。研究指出，无论是血清ICAM-1（serum ICAM-1，sICAM-1），还是循环ICAM-1（circulating ICAM-1，cICAM-1），在肝癌组织中表达水平均明显增高。肝癌组织的ICAM-1水平比癌旁组织、正常肝组织高。随着肝癌的病情进展，ICAM-1水平逐渐增高，肿瘤切除后，ICAM-1水平下降。在肝癌中，转移组的ICAM-1水平比非转移组的高，且在Ⅳ期肝癌中，cICAM-1水平明显高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。cICAM-1水平与AFP呈正相关。1项关于50例肝癌患者AFP与cICAM-1的相关性的研究显示，肝癌患者cICAM-1的水平均明显增高，平均值为2220ng/mL，其中43例（86%）cICAM-1水平超过1000ng/mL，比较AFP与cICAM-1水平，有15例AFP水平仍偏低（低于1000ng/mL）。在肝癌复发早期，当AFP仍未明显增高时，cICAM-1已显示出很高水平，表明cICAM-1可作为肝癌早期诊断及术后复发诊断的重要指标之一。
选择素家族包括选择素P、选择素L、选择素E，它们均具有1个独特的类似凝集素样的细胞外结构，表达于白细胞、活化的内皮细胞及血小板表面，可在血流状态下介导白细胞与血管内皮的起始黏附。选择素E表达于活化的内皮细胞，配体是sLeX（一类含唾液酸、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺和岩藻糖末端的糖类）和与sLeX相关的寡聚糖。在肝癌组织中，选择素E表达在与肿瘤相关的小血管内皮细胞上。在肝硬化发展为肝癌的患者中，选择素E的水平随着病情的进展而降低。在肝癌的癌肿区域，sLeX呈中低度表达的患者比sLeX呈高度表达的患者更常出现血管侵袭，且癌肿直径更大；癌肿区sLeX表达水平比非癌肿区低的患者明显更常出现血管侵袭，提示在肝癌中sLeX的少量表达与肝癌的侵袭有关。整合素家族是细胞表面糖蛋白受体，其配体为ECM成分，所有整合素均是由α和β 2个亚单位组成，它们通过非共价键连接成异二聚体。有研究指出，integrin亚单位α1、α2、α3、α6和β1分布在肝癌细胞的边缘，而β4很少在边缘被测出。α1、α2、α3和β4抗体不能抑制细胞黏附到LN，而α6、β1抗体却可使细胞黏附力下降50%甚至更多，表明α6、β1促进肝癌细胞黏附到LN上，在肝癌细胞侵袭转移过程中发挥了一定作用。另有报道，如果肝癌细胞表达α3、β1，其可分泌白明胶酶（gelatinase），则细胞可顺利通过BM，表明α3、β1活性和gelatinase活性是肝癌侵袭转移所必需的。
钙黏附蛋白（cadherin）是钙离子依赖性跨膜糖蛋白，主要介导同型细胞间的黏附作用。上皮细胞钙黏附蛋白（E-cadherin）广泛分布在成年组织的上皮细胞中，是维护上皮细胞形态、结构完整性和极性的重要分子。在正常细胞内，E-cadherin的表达是稳定的，但在癌细胞中，其表达往往不稳定。研究表明，E-cadherin表达下调与肝癌转移性密切相关，在6.7%肝癌组织中，E-cadherin呈阴性，且其中2例mRNA表达减少，经组织学研究发现这2例已出现侵袭性，说明E-cadherin表达下调对于早期诊断肝癌复发有一定作用，其机制可能是转录或转录后减量调节；同时，E-cadherin在肝癌中的表达下降程度与肝癌组织学分级呈负相关，且低表达水平的E-cadherin提示患者生存率低，预后不佳。而E-cadherin相关蛋白catenin（包括α-catenin、β-catenin、γ-catenin）在肝癌中呈过表达，且在分化程度越低的肝癌中其表达水平越高。β-catenin的高表达水平与血管侵袭呈正相关，γ-catenin的高表达水平与卫星灶的存在呈正相关。
CD44分子是具有高度异质性的单链膜表面糖蛋白，亦是黏附分子，主要配体为透明质酸（HA）。CD44有标准型（CD44s）和变异型（CD44v）2种类型。CD44表达程度与肝癌分化程度相关，分化程度越低，CD44表达水平越高，且CD44v6的高表达与经血管侵袭及p53基因的过表达密切相关。应用Kaplan-Meier生存分析曲线分析，在肝癌组织中越多CD44亚型（包括CD44s、CD44v5、CD44v6、CD44v7-8、CD44v10）表达呈阳性，患者的生存率越低，表明高表达的CD44亚型与低分化肝癌及较低生存率有关。
肿瘤细胞释放各种水解酶类，破坏其黏附部位的组织，即必须破坏ECM和BM。在这一过程中，尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，u-PA）及MMP发挥重要作用。纤溶酶活性系统包括u-PA、u-PAR、PAI-1（plasminogen activation inhibitor type-1）、PAI-2，在肿瘤的侵袭转移中发挥了重要作用。u-PA属丝氨酸蛋白水解酶，它与其受体（u-PAR）在细胞表面高效结合，局部激活纤溶酶，引起ECM和BM降解。u-PA和u-PAR介导的纤溶降解效应主要是在肿瘤侵袭初始，即在突破BM屏障过程中起关键作用。有研究指出，在肝癌中，u-PA及PAI-1呈过表达，尤其在有门静脉癌栓、侵袭转移的肝癌组织中，其表达水平明显高于癌旁组织及对照组。同时，在肿瘤组织和癌栓中，u-PA及PAI-1的mRNA均表达增强。在u-PA、u-PAR和PAI-1均呈阳性的癌组织中，其转移性和移动性更强。在纤溶酶活性系统中，u-PA活性是影响肝癌侵袭的最敏感的因素，是较强的肝癌复发预测指标。当活性u-PA超过0.70ng/mL，临床应该密切随访，注意肝癌复发的可能性。
MMP是先由细胞分泌，而后又在细胞外获得活性的锌离子依赖性酶，可分为4类：①间质胶原酶（MMP-1）和多形核细胞胶原酶（MMP-8）；②Ⅳ型胶原酶，又称明胶酶，包括MMP-2、MMP-9；③间质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10；④膜型金属蛋白酶（membrane-type MMP，MT-MMP）。它们共同维系着ECM的平衡，具有同源性，但其底物不同。MMP-3、MMP-10在肝癌中表达明显增加，尤其在ECM邻近血管处。水平增高的MMP-2（包括潜伏型和激活型）只在肝癌组织表达。
水解酶类破坏黏附部位组织，使肿瘤细胞得以向纵深移动，朝远距离转移。一般来说，具有高度侵袭转移能力的肿瘤细胞往往同时也具有活跃的细胞运动能力。细胞的迁移运动与肌动蛋白-肌球蛋白及其相互作用有关，是信号传导所介导的细胞骨架重组的结果。Rho是与Ras相关的G蛋白家族成员，其对细胞运动的信号传导作用是通过参与对微丝重组的调节进行的。将5种肝癌细胞株转染入裸鼠的肝脏中，构建肝癌转移模型。其中，导入的Li7和KYN-2细胞导致血管瘤栓和肝内转移，且它们在体外的细胞移动性明显比其他3种高。这种细胞高移动性是通过Rho介导血清和溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）激活肌动蛋白重组。p160ROCK（p160 Rho-associated coiled-coil forming protein kinase）是一种Rho相关的丝-苏氨酸蛋白激酶，在Li7细胞中转染入活化的p160ROCK，可不依赖于血清和LPA而提高细胞移动性；转染入失活的p160ROCK则使细胞移动性减低，在体外还使细胞转移率下降，表明在肝癌中通过Rho p160ROCK信号途径介导的细胞移动性在肝内转移中起了关键性作用。
新生血管形成是恶性肿瘤发展的基本特点。不仅原发肿瘤的生长依赖肿瘤血管形成，转移灶的建立也依赖肿瘤血管。实体瘤只有具备了血管生成表型后才能发生恶性生长和成功转移。如果没有血管生成，肿瘤组织可长期处于“冬眠状态”。肝癌主要为多血管肿瘤，故研究血管生成有重要意义。VEGF是目前较受重视的强有力的血管生成因子，是内皮细胞专一的促有丝分裂因子，主要通过内皮细胞上的Flt-1、KDR受体起作用。VEGF在肝癌细胞、肝细胞和内皮细胞上均有表达。研究指出，随着肝癌的形成、发展，VEGF的水平逐渐增高。VEGF的表达程度与血管形成、细胞增殖活性相关，提示VEGF对肝癌的血管形成、癌细胞的生长及肿瘤的发展起显著性作用。血清中高水平的sVEGF与肿瘤有包膜、存在肝内转移、微血管侵袭及肿瘤进展期密切相关。同时，多变量分析结果表明，sVEGF＞500 pg/mL，肿瘤直径＞5cm是术前预测微血管侵袭的独立因素，提示sVEGF水平可作为判断肝癌侵袭及预后的有用的生物学指标。
2.清热解毒类中药抑制肝癌转移的机制 肝癌的侵袭转移是一个多步骤、多因素参与的复杂过程。除上述因素外，其他相关因子在侵袭转移中亦发挥了重要作用，如原癌基因和抑癌基因等。原癌基因的激活（包括Bcl-2、H-ras、mdm2等）、抑癌基因的失活（包括p53、nm23-H1、Kai-1等）均可诱发肝癌细胞转移表型的改变，从而导致转移的发生。对15年来原发性肝癌患者进行随访，其中，371例使用中药，958例未使用中药，每1000例年发病率分别为5.28%和10.18%。可见，使用中药者（超过180天）比未使用中药者肝癌发病风险显著降低。常用的中药和方剂主要有白花蛇舌草、半枝莲、板蓝根、一贯煎等。
华蟾素注射液具有清热解毒、消肿止痛、活血化瘀、软坚散结等作用，故临床常用于治疗痰热瘀结型肝癌。清热解毒类中药联合华蟾素注射液是肝癌患者术后管理常用的药物，可以推迟肿瘤复发和转移，延长生存时间，增加肝癌患者的术后生存率。由莪术、山慈菇、鸦胆子、马钱子及牛黄等中药组成的慈丹胶囊，作为抗肿瘤的中药制剂被应用于临床已有10余年，其联合TACE治疗原发性肝癌可在一定程度上提高近期疗效，并提高生存率。研究者将124例原发性肝癌患者随机分为治疗组和对照组，治疗组用鸦胆子油乳注射液联合TACE治疗，对照组单纯采用TACE治疗，比较2组临床疗效、生活质量、不良反应。结果提示，鸦胆子油乳注射液联合TACE治疗，可提高原发性肝癌疗效，改善症状。有学者观察22例进展期肝癌患者临床疗效发现，TACE联合鸦胆子油乳注射液治疗可显著降低AFP，优于单纯使用TACE治疗。
小檗碱（又称黄连素）作用于肝癌HepG2细胞，可以改变间质细胞的形态，使其向上皮细胞形态逆转，同时提高细胞的上皮细胞特征性分子标志E-cadherin的表达，降低间质细胞特征性分子标志波形蛋白（vimentin）的表达，从而抑制肝癌的侵袭与转移。二黄汤（黄连、黄芩）能够明显下调HepG2细胞内的MMP-2蛋白表达水平，对肝癌的侵袭具有抑制作用。研究发现，白头翁皂苷可以协助索拉菲尼下调MMP-2和MMP-9蛋白表达水平，减弱肝癌细胞对细胞外基质的降解，从而抑制肝癌细胞对其他组织的侵袭。大黄素可以通过ERK信号通路下调MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平，从而有效地阻断肝癌细胞对BM的降解，对肝癌的侵袭与转移具有明显的抑制效应。研究人员将熊胆粉作用于肝癌移植瘤裸鼠，在观察该药对裸鼠血管生成和细胞周期的影响时发现，熊胆粉作用后的移植瘤小鼠的VEGF表达水平显著下降，与移植瘤小鼠MVD下调一致，表明熊胆粉通过下调VEGF以抑制肿瘤血管的生成，进而抑制肿瘤细胞的增殖和转移。蟾毒灵能抑制肝癌细胞的侵袭与转移，其机制可能与蟾毒灵调控Wnt/β-catenin信号通路有关。鳖甲煎丸可以抑制肝癌HepG2细胞的生长、侵袭和转移，其作用机制可能与下调β-catenin表达从而减少相关靶基因CD44v6及VEGF的表达水平有关。
本课题组从干细胞角度探讨了解毒消癥饮抑制肝癌转移的作用，发现解毒消癥饮抑制肝癌干细胞的表达，进而抑制了肝癌的进展和转移。