毒理学基础知识
第十二章 毒理学基础知识
第一节 绪论
一、定义
毒理学是研究外源性化学物质、物理因素或者生物因素对生物有机体的有害效应及其作用机理,预测其对生物有机体和生态系统的危害,为确定安全限值和采取防治措施提供科学依据的一门学科[1][2]。
外源性化学物质是指在生物有机体生活的外界环境中存在,可能与机体接触并进入生物有机体,在体内呈现一定的生物学作用的化学物质。
外源性化学物质暴露于生物有机体,会产生一定的生物学效应。根据效应的性质不同,可以区分为有害效应与非有害效应。毒理学的主要研究对象是外源性化学物质的有害效应,因此必须明确有害效应的概念,与观察到的非有害效应加以区别。
有害效应包括影响生物有机体的生理生化改变、功能紊乱或者病理损害;或者影响生物有机体对外加应激原的反应能力。
非有害效应则具有以下特点,例如不引起形态、生长、发育和寿命的改变;不引起机体功能的损伤;不损害机体对额外应激状态的代偿能力;接触停止后,发生的改变可逆,且不损害机体维持自稳态的能力;不增加机体对其他有害效应的敏感性等。
此外,在毒理学领域,还需要注意一些定义上的差别。比如,毒性是指外源化学物质与机体接触或进入体内的易感部位后,能引起有害效应的相对能力。可简述为外源化学物在一定条件下损伤生物体的能力。而外源化学物质所引起的机体发生生理生化机能异常或组织结构病理变化等有害效应的总和称为毒性作用或毒性效应。对于化学物质来说,毒性是其内在的特性,取决于该化学物质的分子结构,我们一般不能改变化学物质的毒性。而毒性效应是化学物质毒性在特定条件下引起生物有机体产生有害效应的表现,改变相应条件就可能影响化学物质的毒性效应。
毒物[3]是指在较低剂量下,接触或者进入生物有机体,能够产生有害效应的化学物质、物理因素或者生物因素。需要注意的是,任何一种因素,在一定条件下都可能对机体产生有害效应[4]。以化学物质为例,毒性相对较大的化学物质,只要相对较小的剂量即可对生物有机体或者生态系统产生一定的毒性效应;而毒性相对较小的化学物质,需要相对较大的剂量才会呈现一定的毒性效应。决定一个化学物质是否 “有毒”,关键在于该化学物质的暴露量。因此,表征化学物质的毒性效应往往需要与一定的剂量联系在一起。
Paracelsus提出的毒理学基本原则:(1)检测化学物质的效应必须进行实验观察和研究;(2)应该注意区别化学物质的治疗特性和毒性效应;(3)除了剂量之外,有时化学物质的治疗作用和毒性效应不可区分;(4)人们可以查明化学物质的特异性程度及其治疗效应或者毒性效应。
安全限值是指为保护生物有机体、生态环境和/或人群健康和安全,对生活和/或生产环境的各种介质 (如空气、水、食物、土壤等)中相关的各种因素 (化学物质、物理因素和/或生物因素)所规定的浓度和/或暴露时间的限制性量值。在低于此限制性量值时,根据现有的知识,不会观察到任何直接和/或间接的有害效应。即低于此限制性量值时,特定因素对于生物有机体、生态环境和/或人群健康和安全的风险是可以忽略的。
二、毒理学研究范畴[5]
毒理学研究主要通过毒效动力学和毒代动力学两方面对化学物质与生物有机体的有害的交互作用进行观察。毒效动力学研究毒物对生物有机体作用的规律,包括毒物的剂量与毒性效应关系、时间与毒性效应关系、毒性作用机制等。毒代动力学研究毒物在体内的动态变化,即毒物在体内随时间的量的变化和质的改变的规律,包括吸收、分布、转化 (代谢)、排泄等。
毒效动力学和毒代动力学这两个过程是相互联系的。外源化学物质暴露进入生物有机体内,首先经过毒代动力学过程,一部分外源化学物质被吸收后,其本身或者活性代谢产物分布到靶器官中产生有害效应,从而导致毒性效应。同时,由于生物有机体往往有一系列的抗损伤机制,当外源化学物质的有害效应超过生物有机体抗损伤作用时,生物有机体就可能出现一系列的中毒[6]体征或者症状,严重者导致死亡。
根据毒理学研究领域的不同,毒理学可分为描述毒理学、机制毒理学和管理毒理学。分别对应对化学物质的毒性进行的描述性研究、对其毒作用机制进行的深入分析和根据描述毒理学和机制毒理学获得的信息,决定如何对化学物质进行评价和管理等工作。
此外,随着近年来分析化学、生物化学、生物物理学、分子生物学、细胞生物学和遗传学等学科的进展以及相关技术和方法的进步,毒理学的研究内容和研究方法也取得了巨大的进步。相应的,毒理学与这些学科的交叉领域,形成了众多的分支学科,如分子毒理学、遗传毒理学、细胞毒理学等。
第二节 毒效动力学
一、毒性效应分类
外源化学物质对生物有机体的毒性效应主要按以下几个方面进行分类。
1.速发或迟发性毒性效应
外源化学物质在一次暴露后的短时间内引起的毒性效应称为速发性毒性效应。例如氰化物等引起的急性中毒。相对地,在一次或者多次暴露于某种外源化学物质后,经过一定时间间隔才出现的毒性效应称为迟发性毒性效应。例如某些重金属对神经系统的迟发性神经毒性效应;又或者致癌物致人体肿瘤发生的效应,往往在首次暴露的数年甚至数十年后才出现。
2.局部或者全身毒性效应
外源化学物质在机体的暴露部位直接造成的毒性效应称为局部毒性效应。例如暴露于具有腐蚀性的强酸或者强碱会对皮肤或者眼睛造成损伤;吸入刺激性的气体会对呼吸道产生损伤等。相对的,外源化学物质被机体吸收后,通过体液分布,到达远离直接接触部位的靶器官或者全身后产生的毒性效应称为全身毒性效应。例如一氧化碳中毒引起机体全身性缺氧。值得注意的是,有些化学物质兼具两种效应,例如四乙基铅和有机汞化合物可作用于皮肤的接触部位造成接触性皮炎,经过皮肤吸收后,全身分布,对中枢神经系统和其他器官产生毒性效应。
3.可逆或不可逆效应
外源化学物质的可逆效应是指停止暴露于该化学物质后可以逐渐消失的毒性效应。一般情况下,机体暴露于外源化学物质的浓度越低、暴露时间越短,造成的损伤程度也就越轻,脱离暴露后其毒性效应消失得也就越快。相对的,如果停止暴露于外源化学物质后,其毒性效应依然存在,甚至可能对机体造成的损伤可能进一步发展,则被称为不可逆效应。例如,肿瘤发生即被认为是不可逆效应。化学物质的毒性效应是否可逆,很大程度上还取决于靶器官的组织修复和再生能力。例如肝脏的损伤,由于肝脏具有较强的再生能力,大多数的肝脏损伤是可逆的;中枢神经系统的损伤,由于其修复和再生能力差,一般被认为是不可逆的。
4.超敏反应
超敏反应是指机体对外源化学物质产生的病理性免疫反应。外源化学物质可以作为抗原或者半抗原[7],激发机体产生相应的抗体。当机体再次暴露于该外源化学物质或者其结构类似物时,即引发抗原抗体反应,产生超敏反应。
5.特异质反应
特异质反应是指机体对外源化学物质产生的一种遗传学上异常 (过弱或过强)的反应性。其发生主要由于基因多态性造成的个体差异,有别于基于免疫性的超敏反应。
超敏反应和特异质反应因个体而异,在群体中往往仅在少数个体中出现。观察时,其效应往往与剂量无关,也较难构建相关的实验动物模型。
二、选择性毒性
外源化学物质对于不同的物种、同一物种的不同群体或者个体、同一个体中的不同部位、器官或者组织表现出来的毒性效应是不同的。这种选择性毒性使得毒理学动物实验结果向人群外推具有不确定性;体现在暴露于外源化学物质下的群体中存在易受损伤的易感亚群,或称为高危亚群;也表现为当外源化学物质进入机体后,对体内各个器官的毒性效应并不一致。
因此,在外源化学物质暴露下,这些特定的产生选择性毒性效应的器官,被称为靶器官。例如甲基汞、碘化物、镉的靶器官分别是大脑、甲状腺、肾脏。靶器官与效应器官的不同。尽管在许多情况下,外源化学物质作用于靶器官后,其毒性效应直接由靶器官表现出来,此时靶器官是效应器官。但是毒性效应也可以通过某种病理生理机制,由另一个效应器官表现出来。例如,马钱子碱中毒可以引起抽搐和惊厥,其靶器官是中枢神经系统,效应器官是肌肉。
三、剂量
剂量是指实验中给予机体或环境的外源化学物质的量或者机体或环境接触到的外源化学物质的量。通常以机体单位体重接触的外源化学物质的质量(mg/kg体重)或者环境中的浓度(mg/m3空气,mg/L水)表示。
根据具体的情况,剂量还可指:暴露剂量,又称为外剂量,指外源化学物质与机体或者环境接触的暴露量。可以是单次暴露或者某浓度下一定时间的暴露。或者吸收剂量,又称为内剂量,指外源化学物质经过生物屏障后,吸收进入体内的剂量。或者到达剂量,又称为靶剂量或者生物有效剂量,指吸收后到达靶器官、靶组织或者靶细胞的,可与特定器官、组织或者细胞进行交互作用的外源化学物质和/或其活性代谢产物的剂量。
化学物质对机体的有害效应的强度和性质,主要由其在靶器官中的剂量决定。由于实际情况下,靶剂量甚至吸收剂量难以直接测得,而其具有与暴露剂量的强正相关性,因此,通常剂量以暴露剂量来表述。
除了剂量之外,暴露特征是决定化学物质对机体有害效应的另一重要因素。常见的外源化学物质的暴露途径[8]为经口、经皮和吸入。此外,暴露时长[9]和暴露频率[10]也是决定化学物质对机体有害效应的重要因素。
四、剂量 效应[11]关系或者剂量 反应[12]关系
剂量 效应关系和剂量 反应关系是指随着外源化学物质剂量的增减,对机体毒性效应的强度相应地增减,或者群体中出现特定反应的个体频率或者比例增减。剂量 效应关系或者剂量 反应关系可以用数学上的坐标轴曲线表示,即以效应强度或者反应频率为纵坐标,以剂量为横坐标,绘制曲线图。
五、毒性参数
为了定量描述外源化学物质的剂量 效应关系或者剂量 反应关系,通过对动物试验的结果进行记录和分析,可以得到或推导出以下相关的毒性参数值[13]。
绝对致死剂量或者浓度 [absolutelethaldose,LD(C)100],指能引起一组受试实验动物全部死亡的最低剂量或浓度。即如果再降低剂量,就有存活者。但由于个体差异的存在,受试群体中总是有少数高耐受性的个体,故LD100常有很大的波动性,实际意义不大。
半数致死剂量或者浓度[14][medianlethaldose,LD(C)50],指能引起一组受试实验动物半数死亡的剂量或浓度。因为LD50是通过统计学处理得到的数值,较少受到个体耐受性差异的影响,比LD100更为准确。LD50数值越小,表示外源化学物质的毒性越强;反之,LD50数值越大,毒性越弱。LD50是评价化学物质急性毒性大小最重要的参数,也是对不同化学物质进行急性毒性分级的基础标准。
最小致死剂量或者浓度 [minimumlethaldose,MLD(C)或LD(C)01或LD(C)min],指一组受试实验动物中仅引起个别动物死亡的最小剂量。低于此剂量即不能使机体出现死亡。
最大耐受剂量或者浓度[15][maximal tolerancedose,MTD(C)或LD (C)0],指在一组受试实验动物中不引起死亡的最高剂量。接触此剂量的个体可以出现严重的毒性作用,但不发生死亡。
观察到有害效应的最低水平 (LOAEL),指在特定的暴露条件下,通过试验和观察,特定化学物质引起机体的形态、功能、生长发育或者寿命等任一方面,产生与正常对照组相比有统计学意义的显著性差别的,有害效应的最低剂量或者浓度。
未观察到有害效应水平 (NOAEL),指在特定的暴露条件下,通过试验和观察,特定化学物质引起机体的形态、功能、生长发育或者寿命等方面,均未产生与正常对照组相比有统计学意义的显著性差别的,有害效应的最高剂量或者浓度。机体在形态、功能、生长发育或者寿命等方面可以观察到有变化,但是经过专家判断,这些变化为非有害效应。
在实际的试验中,比NOAEL高一个剂量组的试验剂量就是LOAEL。因此,针对不同的试验动物、暴露时长、暴露途径、观察指标,都可以得出不同的LOAEL和NOAEL。在进行讨论和应用时,必须对这些条件进行详细说明。LOAEL或NOAEL是评价外源化学物毒性作用与制定安全限值 (例如每日允许摄入量和最高容许残留限值)的重要依据。
观察到效应的最低水平 (LOEL),指在特定的暴露条件下,通过试验和观察,特定化学物质引起机体产生与正常对照组相比,有统计学意义的显著性差别的,非有害效应的最低剂量或者浓度。
未观察到效应水平 (NOEL),指在特定的暴露条件下,通过试验和观察,特定化学物质不引起机体产生任何效应的最高剂量或者浓度。
效应的阈值是指一种化学物质使机体开始产生效应的剂量或者浓度。效应的阈值应该在试验确定的LOEL与NOEL之间。相似的,有害效应的阈值是指化学物质使机体开始产生有害效应的剂量或者浓度。有害效应的阈值则在LOAEL与NOAEL之间。需要指出的是,在进行风险评估时,由于有害效应的阈值不能通过试验直接获得,因此,通常用NOAEL作为有害效应的阈值的近似值进行计算[16][17]。一般认为,外源化学物质的一般毒性和致畸性毒性效应的剂量 效应曲线是有阈值的。而遗传毒性致癌物[18]和致突变性是没有阈值的。
第三节 毒代动力学
毒代动力学研究的是外源化学物质进入机体体内后的处置过程,简单地说,即外源化学物质的吸收、分布、代谢和排泄过程。其中外源化学物质的吸收、分布和排泄过程称为生物转运;外源化学物质的代谢过程称为生物转化。而外源化学物质的代谢和排泄合称为消除。
一、生物膜与跨膜生物转运
生物有机体是由生物膜系统构成的。外源化学物质的生物转运过程就是通过不同的生物膜屏障的过程。
生物膜为脂质双分子层结构,主要由脂质和镶嵌在其中的蛋白质组成,生物膜表面也含有少量的糖。化学物质通过生物膜的转运方式主要有被动转运[19]、主动转运和膜动转运三种方式。其中被动转运是顺着浓度梯度进行,不消耗能量,这也是外源化学物质最主要的跨膜转运方式。主动转运和膜动转运消耗能量,可逆着浓度梯度进行。主动转运由载体介导,具有可饱和性,例如二价金属离子通过消化道吸收时的跨膜转运。膜动转运分为胞吞和胞吐。胞吞时,如果转移对象是颗粒物,称为吞噬,例如巨噬细胞对外来细菌的吞噬作用;如果是液滴,则称为胞饮。
影响转运的主要因素是化学物质本身的结构、分子量大小、脂 水分配系数[20]、带电性、极性等。一般情况下,空间结构简单、分子量较小、脂 水分配系数较大[21]、不带电荷或者极性较小的化学物质易于跨膜转运。
二、吸收
吸收是指外源化学物质从接触部位,通常是机体的外表面 (如皮肤)和内表面 (如消化道表面的黏膜、呼吸系统的肺泡等)的生物转运至血液循环(或体液)的过程。吸收过程主要的观察对象是吸收的量和吸收的速率。外源化学物质主要通过呼吸系统、消化系统和皮肤进行吸收。
空气中的外源化学物质主要通过呼吸系统被机体吸收。由于从鼻腔到肺泡,各个呼吸道的结构不同,其吸收的情况也不同。经呼吸系统的吸收,主要以肺泡吸收为主。气态物质的水溶性会影响其吸收部位,水溶性高的物质例如二氧化硫、氯气等在上呼吸道吸收,而水溶性低的物质例如氧气、一氧化碳等主要通过肺泡吸收。而影响气溶胶吸收的重要因素是颗粒物的大小,一般认为,空气动力学直径[22]在10μm以上的颗粒物在鼻咽部沉积,这些颗粒物和经口来源的颗粒物在数分钟内被咽下,在消化系统吸收。而空气动力学直径4μm以上的颗粒物通常在上呼吸道沉积,通过呼吸道纤毛的逆向运动,最终会被吞咽并在消化系统吸收。空气动力学直径在4μm以下的颗粒物被认为会进入下呼吸道直至肺泡,由于缺乏纤毛运动,这部分颗粒物将被吸收进入血液循环,或者被肺部的巨噬细胞吞噬,又或在肺部蓄积。
食物和水中的外源化学物质主要通过消化系统被机体吸收。相似的,从口腔到直肠的消化道的结构不同,其吸收的情况也不同。经消化系统的吸收,主要在胃和小肠中进行。非解离的化学物质相对较容易经生物膜扩散,因此考虑到胃、肠道不同的p H,有机酸较易在胃内 (p H2左右)吸收,而有机碱则较易在肠道内(p H6左右)吸收。某些外源化学物质可以通过特殊的主动转运系统吸收,例如铊、钴、锰可以通过铁转运系统吸收;铅通过钙转运系统吸收等。某些外源化学物质通过在消化道中的酶或者菌群作用后,转化成新的化学物质,影响其吸收甚至毒性。例如饮水中含有高浓度硝酸盐,容易引起人工喂养婴儿发生高铁血红蛋白血症,这是因为新生儿胃肠道中p H较高,有些细菌得以存活并还原硝酸盐为亚硝酸盐,从而使血中变性血红蛋白增高。
经过皮肤直接接触或者空气中悬浮物的沉降都会产生外源化学物质经过皮肤的吸收。化学物质经过皮肤的吸收必须通过表皮或者附属物 (包括汗腺、皮脂腺和毛囊)。相似的,机体不同部位的皮肤特性也不一致,从而吸收的情况也不同[23]。不同物种动物的皮肤通透性也不同,其中豚鼠、猪和猴的皮肤通透性与人相似。一般情况下,脂水分配系数高的化学物质易经过皮肤吸收;而相对分子质量大于300的化学物质不易通过皮肤。
此外,需要注意外源化学物质的首过效应现象。首过效应指的是外源化学物质从吸收部位转运到血液循环,尤其是体循环的过程中,已经开始被消除的现象[24]。例如通过消化系统吸收的化学物质在肠黏膜及肝脏转化灭活后,进入体循环的化学物质量显著减少,外源化学物质的毒性效应可能因此大大降低;另一方面,外源化学物质在吸收部位 (例如消化道黏膜、肺、肝等)的损伤作用也可能与首过效应有关。
三、分布
外源化学物质经过吸收进入血液循环或者体液后,化学物质和/或其生物转化产物在体内循环和分配的过程称为分布。
影响化学物质分布的主要因素有五种。
(1)化学物质的性质。一般情况下脂溶性大的化学物质通过生物膜的扩散速率快,分布到组织器官的速度快。
(2)血浆蛋白 (主要是白蛋白)结合率。与血浆蛋白结合后的化学物质,分子量增大,不易通过生物膜,不易产生生物学效应,但是也不受生物转化的影响,不易从肾小球滤过,因此在体内的作用时间也延长。
(3)器官或者组织血流量大小。肺、脑、心、肝、肾、小肠等组织器官血管丰富,血流量大,在初始分布阶段,化学物质的浓度较高。但随着时间延长,分布受到外源化学物质经生物膜扩散速率以及化学物质与器官或者组织的亲和力的影响,引起化学物质在体内的再分布。例如铅一次经口染毒后2小时,50%在肝内储存,1个月后,90%的体内残留的铅与骨骼系统结合。
(4)化学物质与器官或者组织的亲和力。有些化学物质会在特异的器官或者组织选择性地蓄积或者储存。例如多氯联苯、多溴联苯、二
英、DDT等极易分布和蓄积在脂肪组织内;重金属在肝脏、肾脏中的储存;铅在骨骼系统中的储存等。一般情况下,这种蓄积会使化学物质在该器官或者组织中储存,从而降低化学物质在血液循环中的浓度,进而降低其到达靶器官的浓度。但是由于储存器官或者组织中的化学物质浓度与血浆中的游离型的化学物质浓度存在平衡,当血浆中游离型的化学物质被清除后,储存的化学物质又会被释放入血液循环,造成长期的暴露和毒性效应。
(5)生物膜屏障系统。这是机体减少或者组织外源化学物质从血液中进入特定器官或者组织的生理性保护机制。主要有血脑屏障、胎盘屏障和血睾屏障等。这些屏障可以有效地阻止极性大而脂溶性小的化学物质通过,但是不能有效阻止极性小而脂溶性大的化学物质的转运。
四、代谢与生物转化
生物转化是外源化学物质在体内经过酶促或者非酶促反应,引起化学结构发生变化的过程。生物转化后,随着时间的延长,体内外源化学物质本体的量不断减少,其生物转化产物的量则不断增加。经过生物转化后的产物,其反应性或者毒性可能出现降低 (代谢解毒)或者增高 (代谢活化[25])。
外源化学物质的生物转化一般分为两大类,称为Ⅰ相反应和Ⅱ相反应。Ⅰ相反应包括水解反应、还原反应和氧化反应,Ⅰ相反应可以是化学物质暴露或者引入一个功能基团,水溶性可能有少量的增加。Ⅱ相反应主要包括结合反应,例如葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化、甲基化[26]、与谷胱甘肽结合、与氨基酸[27]结合等,大多数的Ⅱ相反应是化学物质的水溶性显著增加,从而加速其排泄。外源化学物质生物转化的主要器官是肝脏。也可发生在血浆、肾、肺、肠及胎盘等。
参与外源化学物质生物转化的酶主要有以下几种。
微粒体细胞色素P450酶系。这是体内主要的催化氧化作用的酶。在微粒体中还有黄素单加氧酶等催化氧化作用的酶。其他的具有催化氧化作用的酶包括存在于胞浆中的醇脱氢酶、醛氧化酶、黄嘌呤氧化酶等;线粒体中的醛脱氢酶、单胺氧化酶等。
在哺乳动物组织中还原反应的活性较低,但是在共生的肠道菌群中还原酶的活性较高。例如硝基和偶氮还原酶系等。
催化水解作用的酶主要有酯酶、酰胺酶、肽酶等,普遍存在于胞浆、溶酶体、血液中。
催化Ⅱ相反应的酶有尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶 (UDPGT)、磺基转移酶、谷胱甘肽S-转移酶等,普遍存在于胞浆、线粒体、微粒体、内质网、核膜等位置。
五、排泄
排泄是外源化学物质和/或其生物转化产物从体内被移出的过程。
肾脏是最主要的排泄器官。肾脏的功能主要包括肾小球在滤过压下的被动滤过作用、肾小管的重吸收作用和肾小管的分泌作用[28]。
胆汁排泄可能是外源化学物质和/或其生物转化产物通过粪便排泄的重要途径。
外源化学物质和/或其生物转化产物经过胆汁排泄进入肠道后,一部分可随粪便排出,一部分可能由于肠道的重吸收作用,再次进入肝脏,这一过程称为肠肝循环。肠肝循环可能使外源化学物质的表观生物半衰期延长,即毒性效应的持续时间延长。例如甲基汞主要通过胆汁排泄,由于肠肝循环,其生物半衰期可以长至70天,临床上会给予中毒者口服巯基树脂,促使甲基汞与其结合,减少重吸收,促进甲基汞从体内清除。
此外还有参与排泄作用的器官还有肠道、肺、汗腺、乳汁[29]、唾液腺、支气管腺等。
需要注意的是,由于物种之间的生理学差异,例如呼吸频率、血流速度、化学物质与血浆蛋白的结合能力、脂肪含量、肝脏的解毒能力、酶系统的差异、尿液的p H、寿命等,都会使在实验动物中观察到的现象不一定能在人体中同样观察到。另一方面,有些人类特异的病理变化,也不能通过实验动物进行模拟。这些差异,是从动物数据向人体外推时物种间的不确定性的主要因素。(https://www.daowen.com)
第四节 毒理学实验
体外实验或者体内动物实验是毒理学研究的重要手段。体外实验可以用于筛选和预测化学物质的毒性效应或毒性作用机制。体内动物实验则以实验动物为模型,通过观察外源化学物质对实验动物的毒性效应,向人体外推,以期获得化学物质对人体的危害信息及进行危害评估。此外,临床观察等人体实验以及流行病学调查的数据也是毒理学研究的重要组成部分,可以进一步深化和验证在毒性作用机制实验或者动物实验中获得的信息。
一、毒理学动物实验的原则
进行毒理学动物实验有三个基本原则。第一,外源化学物质在实验动物中观察到的毒性效应,可以外推到人体。其中包含有两个基本假设。其一,人是最敏感的物种;其二,人体和实验动物体内的生物学过程,例如对外源化学物质的代谢等,与体重或者体表面积[30]相关。一般认为,如果化学物质对于多种实验动物物种的毒性效应相同,则其对人体的毒性效应很可能是相似的。第二,实验动物必须暴露于高剂量,以确保能观察到对人体的潜在毒性效应。毒理学动物实验中,一般要设置多个剂量组,以观察剂量 效应 (反应)关系,确定外源化学物质引起的毒性效应及其毒性参数。如果观察到有害效应的最低水平(LOAEL)与特定使用条件下人体的暴露量接近时,说明该化学物质的这种使用是不安全的;只有当LOAEL与暴露量的距离足够大时,例如100倍,才被认为该化学物质的特定使用是安全的。此外,由于进入实验的动物数量往往较少,对于一些低剂量下发生频率不高的毒性效应,只能通过提高剂量来增加观察到的可能性。第三,一般需要选择成年健康的实验动物以及与人体暴露方式类似的暴露途径。成年健康的实验动物有助于实验结果具有代表性和可重复性,可以降低实验体系本身的系统性误差。而外源化学物质以不同的暴露途径进入实验动物机体,造成的毒性效应可能会有很大差异,因此,选择与人体暴露方式相同或者相近的暴露途径可以最大限度地减少实验结果与真实暴露情况下毒性效应的误差。
需要指出的是,以实验动物的数据向人体外推的不确定性一直存在讨论。这种从动物试验结果向人体外推的不确定性主要基于以下可能的机制。第一,实验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同,有时甚至存在着质的差别。而且实验动物不能述说各种涉及主观感受的毒性效应,例如疼痛、疲乏、眩晕等。第二,有些化学物在高剂量和低剂量的毒性效应规律并不一定一致。在实验中选择的高剂量下观察到的毒性效应不一定能在低剂量中观察到;或者低剂量中的毒性效应在高剂量下已经被更严重的毒性效应掩盖,而不易被观察到。第三,毒理学实验所用动物数量毕竟是很有限的,那些发生率很低的毒性反应,在少量动物中难以发现。第四,实验动物往往是实验室培育的近亲杂交品系,而且一般选用成年健康动物,这就使得实验动物们对化学物质暴露的反应比较单一。而接触化学物质的人群却是多样的,甚至多数情况下包括婴儿、老人、体弱、患病的个体,人们在对外源化学物毒性反应的易感性上存在很大差异。
尽管存在上述种种不确定性,毒理学动物实验仍是对外源化学物质进行研究不可或缺的手段。
二、毒理学实验的目的
为了确定外源化学物质的危害并进行相应的危害评估,开展毒理学实验的主要目的包括:第一,观察、发现并确定外源化学物质毒性效应的性质。在急性或者慢性动物实验中,观察化学物质暴露对机体造成的有害效应是后续研究的前提。第二,记录并研究化学物质的毒性效应的剂量 效应 (反应)关系。剂量 效应 (反应)关系研究是后续危害评估和风险评估的基础,通过对不同有害效应的剂量 效应 (反应)关系研究,可以得到该化学物质的在不同有害效应下的毒性参数。其中比较重要的几个参数是急性致死性毒理学实验中的LD50值;急性非致死性、亚急性、亚慢性、慢性、致畸毒理学实验中的NOAEL、LOA-EL值;以及在致突变性、致癌性毒理学实验中可能获得的表观NOAEL、LOA-EL值。第三,确定毒性效应的靶器官。为阐明化学物质的毒性效应的特点以及进一步研究的毒作用机制和防治措施提供基础。第四,确定毒性效应是否可逆。
此外,为了进行其他研究,例如确定毒性作用机制、毒性效应的早期诊断或者其生物标志物、化学物质在动物体内的生物转运和/或生物转化研究、中毒后的治疗等,可以在常规的毒理学实验的基础上,利用增加观察指标等手段,重新设计,以达到预期目标。
三、毒理学实验的设计原则
体内毒理学实验的设计需要考虑以下原则:
第一,剂量组。一般需要至少设3个剂量组。高剂量组要求应该出现明确的有害效应,或者高剂量组已经达到实验的最高剂量上限。而低剂量组应该不出现任何可观察到的有害效应,即相当于NOAEL;但是低剂量组应该至少高于人体实际可能接触的剂量。中剂量组介于高剂量组和低剂量组之间,应该仅出现轻微的毒性效应,即相当于LOAEL。各剂量组剂量一般按等比设计,间距一般为2或者
第二,对照。常用的对照有空白对照 (未进行任何处理)、阴性对照 (一般为溶剂对照)、阳性对照 (例如在致突变性实验中加入已知致突变物)和历史对照 (同一实验室历年来同一实验体系的对照组数据,可以用来检验实验体系的稳定性。)
第三,样本数量,即动物数量。每组内的动物数量必须考虑满足统计学需要。
第四,随机。样本的分配包括实验操作应该遵循随机原则。
第五,实验期限。某些实验的实验期限会受实验动物物种或品系限制。一般情况下,急性毒性指的是一次暴露或者24小时内的多次暴露,观察期为14天;亚慢性毒性为暴露时间持续至实验动物寿命的10%,大鼠和小鼠一般为90天,犬为1年;慢性毒性或致癌性实验的暴露时间一般持续至实验动物寿命的大部分。
体外毒理学实验的设计需要考虑以下原则:
第一,化学物质在实验介质中的溶解性。溶解性将限制化学物质在测试介质中的最高浓度。
第二,实验最高剂量。考虑到实验时化学物质浓度过高时,可能引起实验体系中渗透压发生变化,从而使实验中的哺乳动物细胞受到损伤或者实验结果出现假阳性现象,因此,可溶性化学物质的实验上限一般定义为10mmol/L或者5mg/m L。对于细菌实验,一般为5mg/平皿。对于具有细胞毒性的化学物质,最高浓度应该是具有明显出现毒性的剂量[31]。
第三,代谢活化。一般在实验中会增加经过S9代谢活化系统[32]活化的实验组,观察化学物质的代谢物是否具有毒性效应。
第四,阳性对照。应该分别选用经S9活化的阳性对照物或者不经S9活化的阳性对照物。同时,阳性对照的结果应该整理构成实验室的历史性对照,方便实验体系的质量控制。
第五,重复。对于可疑的结果,需要重复实验确认。
此外,在毒理学实验中,暴露途径的选择应该尽量模拟人体在化学物质暴露时的暴露方式。最常用的暴露途径为经口、经皮和吸入。其他的暴露途径还有注射等[33]。不同的暴露途径,化学物质最终的生物利用度[34]也不一致,一般情况下,常见的暴露途径中,生物利用度由高到低的排序为:吸入、经口、经皮。
四、常用的毒理学实验方法[35]
常用的毒理学实验方法,可以分为一般毒理学实验,包括急性毒性、局部毒性、皮肤致敏性、亚急性、亚慢性和慢性毒性实验;特殊毒理学实验,包括致癌性、致突变性、致畸性和生殖毒性实验。
急性毒性实验是指实验动物一次暴露或者24小时内多次暴露于化学物质所引起的毒性效应。通常可以为毒理学研究提供最基本的信息。根据人体暴露方式的不同,急性毒性实验的暴露途径主要分为经口、经皮和吸入三种。急性毒性实验主要观察急性毒性效应的表现、剂量 反应关系、靶器官和可逆性等。最主要的毒性参数指标是半数致死量(LD50)。通常选用的实验动物是成年健康的啮齿类动物 (大鼠、小鼠)。
局部毒性实验主要是指眼刺激性实验和皮肤刺激性实验[36]。局部毒性实验观察的是外源化学物质对机体的接触部位产生的毒性效应,但不包括经过接触部位吸收后引起的全身性毒性效应。局部毒性实验中通常固定化学物质的剂量,观察时间与效应之间的关系。通常眼刺激性实验选用的实验动物是成年健康的家兔,皮肤刺激性实验选用的实验动物是成年健康的家兔或者豚鼠。对于强腐蚀性的物质(p H>11.5或者p H≤2)一般可以免除皮肤刺激性实验,皮肤产生刺激效应的化学物质可以免除眼刺激性实验。
皮肤致敏性实验主要是观察实验动物在外源化学物质首次暴露后,免疫系统被激活,在再次暴露于较低浓度的同种化学物质或其类似物时,产生的免疫介导的皮肤反应。皮肤致敏性实验预期通过动物实验预测化学物质是否具有经皮肤暴露引起人类皮肤致敏反应的可能危害。通常选用的实验动物是成年健康豚鼠或者小鼠。
亚急性、亚慢性、慢性毒性实验主要是模拟人体长期暴露于化学物质的情况,也可称为长期毒性实验[37]。由于化学物质在日常生活中的大量使用,人体接触化学物质的频率不断增加。这种长期而反复的暴露在急性毒性实验中难以模拟。化学物质的蓄积作用[38]是发生长期毒性的基础。根据人体暴露方式的不同,长期毒性实验的暴露途径主要分为经口、经皮和吸入三种。长期毒性实验主要观察长期毒性效应的性质、发现在急性毒性实验中未观察到的毒性效应、研究各毒性效应下的剂量 效应关系、靶器官和可逆性、为毒性研究结果向人体外推提供依据。最主要的毒性参数指标是未观察到有害效应水平(NOAEL)和观察到有害效应的最低水平 (LOAEL)。通常选用的实验动物是成年健康的大鼠(啮齿类动物)或者犬 (非啮齿类动物)。
致癌性实验主要用来确定化学物质暴露是否会引起实验动物肿瘤发生,其剂量 反应关系、靶器官等。根据人体暴露方式的不同,长期毒性实验的暴露途径主要分为经口、经皮和吸入三种。通常选用的实验动物是成年健康大鼠或者小鼠。由于致癌性动物实验的要求较高,人力、费用和时间成本巨大,因此在一般情况下,并不会要求进行致癌性动物实验[39]。此外,应用致癌性动物实验的结论外推到人体,需要十分谨慎。由于啮齿类动物具有一些特异性的致病机制,预示着在致癌性动物实验中观察到的某些肿瘤发生,不能作为判断人类致癌性危害的依据。
致突变性实验包括一系列的遗传毒性测试[40],通过直接检测遗传学终点或者遗传毒性相关的现象,确定化学物质是否会引起遗传毒性或损伤,以及这种毒性或损伤是否是可遗传的改变。突变可以分为基因突变、染色体畸变 (CA)和基因组突变。基因突变也称为点突变,一般不能通过光学显微镜直接观察。染色体畸变和基因组突变则是发生在染色体水平的变化,通过特定的处理后,可以用光学显微镜直接观察。遗传毒性测试可以分为体外实验和对应的体内实验。其中,细菌回复突变(Ames)试验由于其快捷、方便成为筛选实验的首选。此外,哺乳动物细胞染色体畸变试验和哺乳动物细胞基因突变试验也是较常用的体外致突变性实验,分别作为筛选实验,观察化学物质是否会引起染色体畸变或者基因突变。在综合分析体外致突变性实验的基础上,如果不能得到足够的信息来判断化学物质是否具有生殖细胞致突变性分类,则需要循序渐进地进行进一步的体内实验。可以选择的体内实验有体内体细胞致突变性试验,例如哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验、哺乳动物红细胞微核(MN)试验、小鼠斑点试验等,可以进一步观察和验证化学物质在体外试验中出现的染色体畸变现象是否在体内也会发生;体内体细胞遗传毒性试验,例如体内肝细胞非程序性DNA合成(UDS)试验、哺乳动物骨髓细胞姐妹染色单体交换试验等,可以进一步观察和验证化学物质在体外试验中出现的基因突变现象是否在体内也会发生;体内生殖细胞突变性试验,例如哺乳动物精原细胞染色体畸变试验、精子细胞微核试验可以进一步观察和验证化学物质在体外试验和/或体内体细胞试验中出现的染色体畸变现象是否在体内生殖细胞中也会发生;体内生殖细胞遗传毒性试验,例如精原细胞姐妹染色单体交换试验、睾丸细胞非程序性DNA合成试验可以进一步观察和验证化学物质在体外试验和/或体内体细胞试验中出现的基因突变现象是否在体内生殖细胞中也会发生;甚至最高要求的体内可遗传性生殖细胞致突变性试验,例如啮齿类动物显性致死突变(rodentdominantlethal, RDL)试验、小鼠可遗传易位试验、小鼠特定位点试验等可以通过直接证据确定化学物质是否具有生殖细胞致突变性[41]的危害。
致畸性和生殖毒性实验主要研究出生前化学物质的暴露导致子代个体的异常发育现象,以及化学物质对亲代个体生殖功能的影响。致畸性和生殖毒性实验主要有生殖/发育毒性筛选试验、出生前发育毒性试验和二代生殖毒性试验,必须以哺乳动物为实验对象,通常选用的实验动物是成年健康大鼠或者家兔。主要的毒性参数指标是针对亲代和/或子代各个毒性效应的未观察到有害效应水平(NOAEL)和观察到有害效应的最低水平 (LOAEL)。需要指出的是,根据目前获得的数据以及关于动物实验结果与对人体的影响的一致性研究显示,尽管需要从动物向人体的外推需要慎重考虑,动物生殖毒性实验结果能够预测化学物质对人体的影响。此外,在注意致畸性和生殖毒性的同时,还需要考虑哺乳行为引起的化学物质对子代的暴露。
急性水生生物毒性实验主要研究化学物质在短期的暴露下对水生生物的效应。观察受试水生生物急性毒性效应的表现和剂量 反应关系,确定半数致死浓度(LC50)或者半数有效浓度 (EC50)。通常选用鱼、溞或者藻[42]作为不同营养级的受试生物。
长期水生生物毒性实验主要研究化学物质在长期或者反复暴露下对水生生物的效应。观察受试水生生物急性毒性效应的表现和剂量 反应关系,确定未观察到效应的浓度 (NOEC)或者EC10或EC20[44][43]。通常选用鱼、溞或者藻[44]作为不同营养级的受试生物。
对于土壤或者底泥中的微生物[45]、陆生生物和鸟类,也有相应的实验导则指导如何进行急性毒性或者长期毒性实验,以确定L(E)C50和NOEC等毒性参数。通常选用蚯蚓、蜜蜂、鹌鹑和鸽子等作为受试生物。
五、毒理学实验的统计学要求
毒理学实验的统计学要求主要体现在两个方面。
第一,在进行毒理学实验设计时,需要遵循随机原则,样本量和/或重复次数需要具有统计学意义。即实验各组之间的样本需要具有同质性,各暴露组与对照组的非实验因素应尽可能一致。这就要求各组样本的分组以及实验中的操作应该遵循随机化原则。在一些定性的观察中,尽量选择盲法或者双盲法,以消除实验设计者对于观察结果的偏爱。此外,实验中需要考虑样本量是否具有足够的大小,和/或重复次数是否适当,以估计各暴露组内、暴露组之间、实验室内或者前后、实验室之间产生的数据之间可以相互比较或者印证。
严格执行上述毒理学实验设计的统计学要求,可以保证得到的结果的可靠性和可重复性,是进行进一步实验结果的统计学分析的基础。
第二,对于实验结果的统计学分析。毒理学实验通常由化学物质暴露的剂量水平和相应的效应 (反应)的观察值组成。通过比较实验中暴露组与对照组的观察值 (平均值和方差),经过不同的统计学假设、拟合、分析和检验,获得最终的判断,即所观察到的化学物质暴露时产生的效应与对照组相比是否具有统计学意义。
这里需要指出的是,具有统计学意义的变化,不一定具有生物学意义。即暴露组的有些观察值可能与对照组相比有统计学意义上显著地升高或者降低,但是这种变化,不具有生物学意义,例如没有剂量 效应 (反应)关系和组织学改变支持的血液分析指标变化。同样的,具有生物学意义的变化,也不一定具有毒理学意义 (有害效应),例如有些具有非有害效应的生物学意义的变化,不会被认为具有毒理学意义。
六、优良实验室规范
为了保证实验数据的真实性、完整性和可靠性,以及促进来自不同实验室的数据的可比性,1976年,美国FDA颁布了优良实验室规范(Good Labora tory Practice,GLP),并被世界各国相继采纳。GLP实验室通过对整个实验过程,从实验方案、操作程序、样品和标本的管理、原始数据、档案保存等全面的管理,来保证对实验的质量控制。GLP实验室的各项工作都要形成文件,以期尽量减少各种主客观因素的干扰,规范实验按标准运行,从而使获得的实验结果准确、可靠。
针对外源化学物质进行的新的毒理学实验,根据世界各主要国家的要求,普遍要求遵循GLP原则,以保证所获得的数据的可靠性。
七、毒理学动物实验3R原则
可以看到,为了预防和治疗人类的疾病、确定化学物质对人体的危害,实验动物做出了巨大的贡献。人类应给予实验动物诚挚的尊重和保护。因此,在进行毒理学动物实验时,需要遵循3R原则[46],即替代、减少和优化。替代即尽量应用无知觉材料的科学方法来代替使用脊椎动物的实验方法。减少即在能保证获得足够可靠的信息前提下,使用尽量少的实验动物数量。优化即在必须使用实验动物时,要尽量减少非人道程序对实验动物的应用范围和程度。
[1]① 毒理学的定义是在不断地发展中的。作为一个广泛的多学科交叉体系,毒理学的定义从最早期的“作为观察和描述毒物及其对生物有机体的效应的学科”,到 “研究因毒物对活体生物有机体和生态系统的有害作用产生的实际的或者可能的危险,研究该有害作用和毒物暴露的关系,研究该毒物的毒作用机制,研究对于中毒的诊断、预防和治疗的学科”,到 “研究化学因子、物理因子和生物因子与生物有机体的有害交互作用的科学”(周宗灿 《毒理学基础》2006年版),处于不断的修订中。本文中采用的毒理学的定义也只是毒理学众多定义之一,读者在阅读时,请予以注意。
[2]② 由于毒理学的发展很大程度上脱胎于药理学的发展,因此毒理学的诸多定义和概念也来源于药理学。因此下文中多数的定义与概念更多与人体健康效应相关;相应地,环境毒理学的定义未完全表述。读者在阅读时,请加以甄别。
[3] 毒物的概念与管理毒理学密切相关。根据不同急性毒性、亚急性毒性、亚慢性毒性、慢性毒性以及致畸性、致癌性、致突变性、靶器官毒性的证据,管理者可以对毒物进行相应的分类、标识和管理。
[4] 16世纪瑞士医生帕拉塞尔苏斯 (Paracelsus,1493—1541)就曾指出 “Alle Dingesind Giftund nichtsis tohne Gift,alleindie Dosismachtes,dassein Dingkein Giftist.”(德语)即 “所有的东西都是 ‘有毒的’;剂量是区分是否毒物的关键。”Paracelsus被认为是现代毒理学之父,他提出的毒理学基本原则现在仍在沿用。
[5] 从此处开始,主要讨论化学物质因素引起的有害作用以及毒理学对于化学物质的研究。读者在阅读时,请加以甄别。
[6] 中毒是指生物有机体受到毒物作用后,引起机体发生功能性或者器质性改变,出现的病理体征或者疾病状态。根据病变发生的快慢,中毒可以分为急性中毒和慢性中毒,以及介于两者之间的亚急性中毒。此外,需注意在慢性中毒时,有时会出现急性发作。
[7] 大多数外源化学物质由于其分子较小,并不是作为完全抗原,而是作为半抗原。其进入生物体内,先与内源性蛋白质结合形成完全抗原,然后进一步激发抗体产生。
[8] 像药物等一些特殊化学物质还有注射等暴露途径。
[9] 毒理学实验中一般将暴露时长分为急性、亚急性、亚慢性、慢性四个范畴。以啮齿类动物为例,急性毒性试验一般指24小时内一次或者多次暴露;亚急性毒性试验一般指在1个月内或者更短的时间内重复暴露;亚慢性毒性试验是指在1个月到3个月内的重复暴露;慢性毒性试验是指3个月以上的重复暴露。
[10] 化学物质一次暴露于某剂量下可能造成严重的毒性效应;但是分次暴露于相同的总剂量下,可能不会引起毒性效应。这主要与化学物质在体内的消除速率有关。如果化学物质在体内的消除半衰期长于暴露频率,该化学物质即易于在体内蓄积从而产生毒性效应。
[11] 效应指的是量反应,一般表示暴露于一定剂量的外源化学物质后,机体的整体水平、器官水平、组织水平或者细胞水平发生的生物学变化。这种变化通常是连续性的变量,可以用计量单位来表示,例如克或者毫克、mol/L、当量单位等。
[12] 反应指的是质反应,一般表示暴露于一定剂量的外源化学物质后,群体中出现某种特定反应的个体在群体中所占的比例。一般用百分比、频率等表示,例如特定反应的有或无、死亡率、突变发生率或肿瘤发生率等。
[13] 一般毒性参数值可分为两类。一类为毒性上限参数,是在急性毒性试验中以死亡为终点的各项毒性参数;另一类为毒性下限参数,即有害效应阈值及最大无有害效应剂量,可以从急性、亚急性、亚慢性和慢性毒性试验中得到。
[14] 环境毒理学中,类似的也有半数致死 (或者有效)浓度的概念,用于表示一群水生生物中的50%个体在一定时间内出现死亡 (或者丧失特定功能)时,外源化学物质在介质 (如水)中的浓度。
[15] 曾经用MTD(C)表示过急性毒性试验中的最大非致死剂量或者浓度,引起术语混乱。目前, MTD(C)仅用于亚慢性毒性试验和慢性毒性试验的实验设计中。
[16]② 当试验中仅能获得LOAEL值时,根据具体情况,也可以引入相应的不确定性因子对LOAEL进行校正,然后计算。
[17]③ 需要注意的是,在应用实验所得的毒性参数进行计算和讨论时,必须对试验动物、暴露时长、暴露途径、观察指标等条件进行详细说明。
[18] 在致癌性试验中,一般能获得S形的剂量 反应曲线,并可观察到表观的LOAEL和NOAEL值。80年代曾经试图通过对遗传毒性致癌物2-乙酰氨基芴 (2AAF)进行一项大规模的剂量 反应研究,即 “百万小鼠”试验 (Staffaetal,1980)。此试验利用雌性BALB/c St Cifl C3H/Nctr小鼠(本体肿瘤发生率低,寿命加长),总共24192只小鼠分别给予不同剂量的2AAF(饲料中浓度0mg/kg,30mg/kg,35mg/kg,60mg/kg,75mg/kg,100mg/kg,150mg/kg,喂饲15个月),动物分别于第9,12,14,15,16,17,18,24,33月处死。结果显示,2AAF诱发的肝细胞癌的剂量 反应曲线接近直线,其潜伏期可达18个月,不能确定阈值。此试验提示利用动物进行致癌性试验来精确研究低水平肿瘤发生的剂量 反应关系是不可能的。此后,一般都认为遗传毒性致癌物是没有可检测的阈值的,没有必要进行更大规模的致癌试验。
[19] 包括简单扩散、易化扩散和滤过。其中易化扩散由载体介导,具有饱和性,例如葡萄糖通过红细胞膜。
[20] 脂 水分配系数是指当化学物质在脂相和水相的分配达到平衡时,其在脂相和水相中溶解度的比值。在实际工作中,通常以正辛醇 水分配系数 (Octanol-waterpartitioncoefficient,Pow)来表示。
[21] 需要注意的是脂 水分配系数极高的外源化学物质易存留在生物膜的脂质双分子层中,反倒不易通过生物膜。
[22] 空气动力学直径 (Aerodynamicdiameter,AD),是用于表述粒子运动的一种假想粒径。不同形状、密度、电性的颗粒物在表观的空气动力学行为上可能具有相同的特征。其定义为单位密度(ρ0=1g/cm3)的球状粒子,在静止空气中作低雷诺数运动时,达到与实际待测粒子相同的最终沉降速度 (vs)时的直径。也就是将实际的待测颗粒的粒径换成具有相同空气动力学特性的球状粒子的等效直径 (或等当量直径)。即指某一特定粒子,不论其大小、形状、密度、电性如何,如果它在空气中的沉降速度与一种密度为1g/cm3的球型粒子的沉降速度一样时,则这种球型粒子的直径即为该种粒子的空气动力学直径。空气动力学直径可由试验测得。
[23] 一般情况下,人体不同部位皮肤的通透性大小顺序如下:阴囊、腹部、额部、手掌、足底。
[24] 硝酸甘油如果口服,大约99%可被肝脏首过效应而灭活失效。所以一般用舌下给药,可不经肝门静脉直接进入体循环,破坏较少而作用较快。
[25] 化学物质本身或者其经过代谢活化后的产物或者其代谢过程中产生或激活的内源性毒性物质 (例如氧自由基、脂质过氧化物等),与内源性靶分子反应并造成机体损伤时的分子形态,称为终毒物。
[26] 甲基化一般会使化学物质的脂溶性增加。
[27] 主要为谷氨酸、牛磺酸、甘氨酸等。
[28] 外源化学物质和/或其生物转化产物可能由于这些不同的机制造成肾脏的损伤,例如肾脏近曲小管可以重吸收小分子量的血浆蛋白,与金属硫蛋白结合的镉就很容易在近曲小管富集从而导致肾脏损伤。
[29] 需要注意的是,高亲脂性化学物质或者其生物转化产物通过乳汁的排泄具有重要的毒理学意义。例如,一些化学物质或者其生物转化产物可能通过母乳暴露于婴儿;牛奶中可能含有饲养环节中不小心掺入的化学物质或者其生物转化产物。
[30] 产生毒性效应的化学物质剂量,如果以体重计算,人体通常比实验动物敏感;如果以体表面积计算,则人体与实验动物非常接近。
[31] 对于哺乳动物细胞试验,最高剂量组在基因突变试验中应该保证至少有10%~20%的细胞存活,在染色体畸变试验和UDS试验中,应该保证至少有50%的细胞存活。
[32] 用哺乳动物如大鼠,经诱导剂 (一般为多氯联苯,主要是四、五、六氯联苯的混合物)处理,取肝组织制备匀浆,9000g低温离心,上清液即为s9组分。其主要有效成分为混合功能氧化酶 (Mixed Function Oxidase,MFO)系统。
[33] 需要注意的是不同的暴露途径的吸收速率不同,一般情况下吸收速率由快至慢的顺序为:静脉注射、吸入、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射、经口、皮内注射、经皮等其他途径。
[34] 生物利用度是指化学物质被机体吸收进入体循环的相对量,用F表示,F=(A/D)×100%。A为进入体循环的化学物质 (表观)总量,D为总暴露剂量。
[35] 美国环保署预防、农药及有毒物质办公室 (USEPAOPPTS)测试导则列表和经济合作与发展组织(OECD)测试导则列表请参见附录十。
[36] 一般情况下,刺激性指的是眼睛或者皮肤暴露于化学物质后引起可逆性的变化;腐蚀性指的是眼睛或者皮肤暴露于化学物质后引起的不可逆损伤。
[37] 一般情况下,慢性毒性实验往往需要大量的人力、物力和时间。因此,亚急性毒性实验和亚慢性毒性实验具有一定的筛选作用。在风险评估中,也常采用亚急性毒性实验和亚慢性毒性实验的毒性参数值进行进一步计算。
[38] 机体连续暴露于外源化学物质后,其吸收速率超过消除速率时,化学物质在体内的量逐渐增加,称为化学物质的蓄积作用。
[39] 以欧洲REACH法规为例,只有在同时满足下列条件时,才需要进行致癌性动物实验:第一,该化学物质是广泛分散使用或者已有证据证明该化学物质有频繁或者长期的人体暴露存在;第二,该化学物质GHS分类为 “由于有可能导致人类生殖细胞产生可遗传性突变而需要关注的物质”(GHS致生殖细胞突变性2类)或者在长期重复暴露的动物实验中有证据表明该化学物质能够诱发增生性和/或肿瘤前病变。
[40] 致突变性是指化学物质、物理因素或者其他环境因素导致生物体个体或其细胞水平的遗传物质发生可遗传的变化的能力。这种可遗传的变化称为突变。遗传毒性是一个更加广泛的概念,泛指任何对遗传物质或者相关的功能蛋白的损伤效应,这些效应可能导致突变,也可能被生物体的修复机制修复。
[41] 生殖细胞致突变性是GHS关于致突变性的分类。其意指化学物质是否具有引起人类生殖细胞发生可遗传给后代的突变。因此,其试验的安排也是循序渐进的。通常如果更高阶的实验结果与低阶的筛选实验结果有冲突时,高阶的实验结果可以推翻低阶的实验结果。例如在体内的致突变性实验结果显示阴性时,可以推断体外致突变性实验结果可能为假阳性。详细的遗传毒性测试策略和相应的GHS分类原则可以参考REACH法规的指南文件。
[42] 适当时,可以用浮萍(Lemnasp.Growth Inhibition Test,OECD221)代替。
[43] 由于NOEC在很大程度上有赖于实验设计本身,因此近年来越来越多的研究应用EC10或EC20来作为毒性参数,用于PNEC的推导。
[44] 藻类的72小时生长抑制实验(Freshwater Alga and Cyanobacteria,Growth Inhibition Test,OECD201)通常也作为藻类的长期毒性实验。
[45] 活性污泥呼吸抑制实验 [Activated Sludge,Respiration Inhibition Test(Carbon and Ammonium Oxida-tion),OECD209]是比较常用的观察化学物质对底泥中微生物的毒性效应的实验。
[46] William Russell,Rex Brursh,1959,The Principleof Humane Experimental Technique.
