骨骼肌热休克蛋白改变的意义

4 骨骼肌热休克蛋白改变的意义

因为应激反应代表了一个基本的细胞防御机制，所以学者们都赞同这种反应的重要性。应激蛋白HSPs不仅是反映肌肉应激的指标，而且在肌肉损伤和疾病过程中发挥保护作用。

4.1 热休克蛋白在病理状态的表达

微管聚集肌病症状包括肌肉僵硬和疼痛，说明可能和炎症有关[1]。因为HSP70是受促炎细胞因子TNF-a、IL-1a、IL-6等调节的，所以可以部分解释为什么微管聚集疾病伴随HSP70表达升高[2]。HSP70表达升高参与蛋白结构变性的调节，也可能涉及微管聚集病理基因和其他微管不正常活动的调节。Vajsar汇报了一种罕见的家族性的与结蛋白 (desmin) 有关的骨骼肌疾病。在这种病中小热休克蛋白泛素有较高的表达[3]，此疾病也与另一种小热休克蛋白αB-crystallin有直接的关系，在αB-crystallin基因敲除的小鼠动物模型可发生以desmin聚集和肌肉降解后期发作为特征的骨骼肌疾病[4]。激活HSPs合成的病理、生理信号和HSPs的功能概括图见图2。

几位学者曾报道，热休克蛋白在另一种骨骼肌疾病杜氏肌营养不良症 (DMD) 中也有较高的表达，DMD是由dystrophin基因缺陷引起的一种严重的基因紊乱病，经常导致肌肉坏死。有趣的是，随着病情减轻，与本病相连的HSP70的过表达也减少，而HSP90、GRP75等表达水平仍很高[10]。在另一种骨骼肌疾病，即强直性肌营养不良中，小热休克蛋白“强直性肌营养不良蛋白激酶结合蛋白 (MKBP) ”在骨骼肌表达上调[11]。

HSPs表达在肌萎缩研究中曾有较多报道。骨骼肌肌萎缩可能是由于蛋白降解加速和/或蛋白合成抑制所致。例如，Baracos etal． 发现在长肿瘤的大鼠发生的肌萎缩是由于肌肉蛋白水解和肌肉废用所致，此时有泛素和蛋白酶合成[12]。HSPs在肌萎缩中的表达是肌纤维类型特殊的，例如，Sakuma et al． 观察到小热休克蛋白包括a B-crystallin、HSP27和P20在dy mouse (与DMD相似的疾病，但是变异基因位于10号染色体) 胫骨前肌 (快肌)表达增加，而在比目鱼肌 (慢肌) 减少。肌萎缩的另一个发生机制是蛋白合成抑制。Ku et al． 研究证明在失重的肌肉ATP浓度增加，导致HSC/HSP70与多核糖体的联系减少，多核糖体沉淀，使核糖体的转位减慢，最终使蛋白合成受到抑制[13]。

HSPs在肌肉肥大中的作用也有很多研究。已发现肌肉肥大实验室模型 (代偿性肥大和拉伸肥大) 显示出在肥大的肌肉HSP72含量增加，而自然工作状态下诱导的肥大没有导致HSP72表达改变[14]。肌肉肥大，是肌细胞体积增大，而细胞数量没有增加，是有丝分裂期后的骨骼肌细胞适应性改变的结果。

4.2 热休克蛋白和组织特异性

众所周知，骨骼肌是由肌纤维组成的，肌纤维由收缩蛋白组成。用免疫组织化学方法可以区分出肌球蛋白重链 (MHC是主要的收缩蛋白) 的几个亚型[15]，例如MHCI主要存在于具有有氧氧化能力的慢肌，而MHCIId/x存在于具有无氧氧化能力的快肌，MHCIIa是中间型[16]。骨骼肌由不同的肌纤维类型组成，不同的肌纤维类型有不同的功能和生物化学特性，对HSPs的表达和反应也是如此。

事实上，HSPs表达不仅是器官或组织特异的，而且具有肌纤维类型特异性[17]。Inaguma et al． 观察到由于后肢去神经而引起的渐进性的改变，他们发现小热休克蛋白p20在大鼠发育阶段快速的增加，在由于去神经导致慢肌纤维减少后p20降低[18]，他们建议大鼠后肢p20表达与肌肉收缩相关，p20特异性地存在于慢肌。αB-crystallin在有氧氧化能力强的组织有丰富的表达[19]，研究发现低频慢性运动神经刺激典型地引起快肌向慢肌转化，快速引发αB-crystallinm RNA和蛋白在收缩的骨骼肌合成。在针对区分myosin各亚型的免疫组织化学连续切片显示，αB-crystallin表达只存在于慢I型肌纤维和快IIa型肌纤维，表明αB-crystallin的表达具有肌纤维类型特异性的特点。进一步研究发现在患有骨骼肌肌病的小鼠小热休克蛋白αB-crystallin，p20和HSP27在快肌纤维表达增加，而在慢肌纤维消失。

关于HSP70表达和肌纤维类型特异性的研究表明，诱导型HSP70存在于大鼠骨骼肌I型肌纤维，不存在于IIb型肌纤维。在混合型肌肉HSP70的量粗略与I型肌纤维的含量成正比[20]。尽管HSP的量与氧化能力及线粒体的量相关，但是HSP在肌组织呈组织特异性表达的原因仍然没有被完全理解[21]。而且，有证据表明虽然HSP72在I型肌纤维有较高的表达，但是在心肌细胞含量却较低，心肌细胞是含线粒体高、有氧氧化能力高的组织。因此进一步的研究需要阐明HSP在骨骼肌呈特异性表达的准确机制。

4.3 缺血—再灌注和骨骼肌热休克蛋白

缺血是导致组织损伤的一个重要原因。大量的研究报告了缺血和再灌注的组织和器官存在应激反应。相比较来讲，有关心肌的研究比骨骼肌更广泛、更多。在心肌由热休克预处理诱导的热休克蛋白对心肌缺血和再灌注引起的损伤有交叉保护作用，这个结论已基本得到公认。而在骨骼肌，这种热应激诱导的交叉保护作用的研究还在继续，研究结果很不一致。例如，Lilleetal． 的研究结果认为由预热应激诱导的HSP70不足以对骨骼肌的缺血—再灌注损伤提供保护作用[22]。而Diana A． 的研究结果认为预热应激诱导的HSP70能够对抗骨骼肌缺血再灌注损伤[23]。看来，有关骨骼肌缺血再灌注方面的内容还需进一步研究。

缺血可导致细胞内钙超载、膜损伤、自由基增多等很多细胞内环境改变。所有这些改变都是诱导HSPs增多的刺激因素。另外，有人观察了外周动脉闭塞病人的骨骼肌肌球蛋白重链各亚型的改变，在这份研究中发现，Ⅱb向Ⅰ型肌纤维转变，作者认为这种转变可能和缺血骨骼肌较高的HSPs的表达相关[24]。

缺血诱导热休克蛋白表达的机制还没有被完全理解，也许是非常复杂的。缺血引起的细胞内环境的改变也许会激发细胞通过合成保护性的热休克蛋白，在不利的环境下生存。由于缺血氧气供应不足，导致能量不足，从而引起氧化还原失衡，特定蛋白的结构不稳定，所有这些因素都可能激发热休克反应，热休克蛋白合成增加[25]

有关HSPs与骨骼肌缺血再灌注的研究有重要的生理学意义，因为不仅缺血诱导的热休克蛋白可以对缺血的肌细胞起保护作用，而且热休克蛋白的表达也是反映细胞应激状态的指标。

4.4 运动和骨骼肌热休克蛋白

大约20年前，人们发现运动能够诱导热休克蛋白的表达[26]。现已证明，运动能够诱导HSP70在血液、肝脏、心脏、骨骼肌表达增多。到目前为止，已发现运动能够诱导不同种类的热休克蛋白在骨骼肌表达。研究报道[27]，1h的力竭跑，或3h的神经刺激引起肌肉收缩后即刻HSP32 (亚铁血红素加氧酶-1) m RNA增加7倍或4倍。在运动后的恢复期间，有c-fos、αB-crystallin和HSP70m RNA表达增强，应激蛋白基因在运动后的恢复过程表达增强，表明应激蛋白在肌肉连续收缩运动后的再重建过程中有特殊的作用[28]。研究还表明，运动能够诱导骨骼肌线粒体HSPs包括HSP60和GRP75表达，而且线粒体HSPs的表达调节是独立调节的，具有特殊性[29]。另外，运动诱导的骨骼肌热休克蛋白的表达具有肌纤维类型的特异性。

运动诱导热休克蛋白表达的机制可能是复杂的、多因素的。运动过程中引起的体温升高可能对热休克蛋白的表达起一定的作用。然而，有研究认为运动诱导的HSP70改变不受体温的影响，建议运动引起的细胞内其他的变化因素，可引起HSP70表达上调。实际上，运动可引起细胞各种各样的改变，例如，乳酸增加、钙超载、自由基增加等，所有的这些改变都可以引起热休克蛋白表达增加[30]。

4．4．1 运动时动物骨骼肌热休克蛋白变化的研究

HSPs表达具有时间和强度依赖性。1990年Locke等[31]首次报道一次力竭性运动可诱导大鼠淋巴细胞、脾细胞、和比目鱼肌细胞内 HSP72 和 HSP90 的合成。同时也发现有 HSP65 和HSP100合成，且HSP72和HSP65的合成随运动强度和时间的延长进行性增加，而HSP100及小分子HSP只是在力竭或接近力竭时才被诱导表达。为进一步验证运动时间与HSP表达的关系，Locke等[32]让大鼠在跑台上以24m/min的速度运动0，20，40， 60min或至力竭，再测定其心肌的HSF活化程度，发现运动20min后的大鼠心脏开始出现不同程度的HSF活化。Salo等[33]通过大鼠力竭跑台运动 (持续时间64．9min±8min，速度26．8m/min，坡度10%) 发现运动后大鼠比目鱼肌、趾长伸肌和心肌中HSP72m RNA的表达也增加。

运动训练对HSP的影响具有器官差异。Samelman[34]观察到长期训练后不同的组织部位HSP的改变不同。他分别测定了长期训练前后左心室 (LV)、右心室 (RV)、心房 (AV)、比目鱼肌 (SOL) 和腓肠肌 (LG) 的HSP72/3和HSP60安静值的变化，发现训练使LV、RV、SOL中HSP72/73和HSP60的水平显著升高，而在AT和LG则未发生改变，研究同时还发现LV、RV和SOL中氧化酶如柠檬酸合酶和细胞色素C氧化酶的活力比AT和LG中要高得多，HSP改变的差异是否与此有关还有待于进一步研究。

运动训练对HSP的影响和年龄有关。随着年龄的增长，应激状态下HSPm RNA和HSP70的功能和合成均有所降低，又由于生理老化以机体对环境应激的反应能力下降为特征，所以， HSPs表达的改变不仅可能是细胞老化的因素，而且还可以作为判断细胞生理状态和应激能力的指标。Naito等[35]研究了长期运动训练对成年鼠和老龄鼠骨骼肌 HSP 表达的影响。雌性Fisher344大鼠随机分为静止对照组和训练组，训练组大鼠以77%VO2max在跑台上完成60min/d，5d/周，共10周的运动训练。训练结束后，分离比目鱼肌 (SOL)、趾长伸肌 (EDL) 和腓肠肌中的红肌 (RG) 与白肌 (WG)。结果发现，运动训练能够明显提高年轻鼠和老龄鼠上述4种肌肉中HSP72的表达。在年轻鼠，SOL、EDL、RG和WG中HSP72的表达分别提高了22%、94%、44%和243%; 在老龄鼠，SOL、EDL、RG和WG中HSP72的表达则分别提高了15%、73%、38%和150%。结果提示，在快肌和慢肌中，HSP72的运动性积累存在差异，在高氧化型骨骼肌 (SOL和RG) 中，HSP72的积累相似，不存在年龄差异; 而在快肌 (EDL和WG) 中，HSP72对运动训练的反应减弱与衰老有关。

HSP对急性运动的反应具有性别差异。Paroo等[36]的研究发现，运动后雄性鼠比雌性鼠HSP70的变化大，而雌激素水平可能是造成这种差别的原因之一，切除卵巢的雌鼠，运动后HSP70的变化幅度增大。

4．4．2 运动时人体骨骼肌热休克蛋白变化的研究

Febbraio[37]观察了长时间力竭运动中，人骨骼肌中HSP72m RNA的变化情况。实验对象以63%VO2max自行车运动至力竭，运动10min时，股外侧肌的HSP72m RNA没有升高，而运动至力竭前 40min 时 ( 力竭时间为 114min±7min)， HSP72m RNA 比运动前升高了 2．2 倍; 运动至力竭后， HSP72m RNA比运动前升高了2．6倍，说明HSP72m RNA表达的上升，需要运动应激作用一段时间，而随着运动应激时间的延长，HSP72m RNA会逐渐积累。但HSP70m RNA的升高未必会造成HSP70含量的显著变化，Puntschart等[38]观察到用无氧阈跑速跑30min后，人骨骼肌HSP70m RNA水平在运动后即刻、30min和3h一直都保持高水平，但HSP70在运动结束3h内未发生明显改变，推测可能是因为一次运动不足以改变骨骼肌内HSP70较高的基础值，导致运动后合成的HSP70总量相对较少，或是与人HSP72m RNA转录效率有关，或者HSP70的诱导合成滞后时间较长 (＞3h)。总之，是否人的骨骼肌HSP70在蛋白水平能够被运动诱导值得研究。Liu Y等[39][40][41]系统的对此问题进行了研究。在第一份研究中，他们让经过良好训练的划艇运动员参加一个为期四周的耐力性训练，四周后取肌肉活检观察肌肉中HSP70的变化情况，结果显示，四周的划桨训练使HSP70显著性的增加，HSP70反应似乎是与训练的总量相关的。然而，在这份研究还不能确定HSP70表达增加主要是依赖于运动强度还是运动量。因此，他们又进行了进一步的研究，研究分别采用运动强度训练组和运动量训练组，然后比较两组HSP70表达的情况，研究认为HSP70反应主要依赖于训练强度，而不是运动量。在这份研究中运动量组主要采用耐力训练，那么较低强度的耐力训练是否能诱导HSP70表达呢? 于是他们又进行了第三份研究，在这个研究中划艇运动员的训练方案分为两个阶段，第一个阶段进行高强度的耐力训练，第二个阶段采用低强度的耐力训练。他们发现在高强度训练阶段HSP70显著性的增加，而在低强度训练阶段HSP70没有变化，研究结论认为受过良好训练的划桨运动员在进行低强度耐力训练过程中，骨骼肌HSP70没有发生变化。这个研究结果与Mattson et al．[42]的研究结果不同，Mattson et al．研究发现在低强度耐力性的跑台跑训练中线粒体蛋白HSP60表达增加，并且伴随着肌肉线粒体数量的增加而增加。可能是由于他们研究的热休克蛋白种类和研究对象的不同造成两份研究结果很不同，或者这些结果不适合于进行直接的比较。

研究运动对骨骼肌HSPs (尤其是对人的骨骼肌HSPs) 的影响，无论在生理学还是在临床方面均具有重要的意义。一方面HSPs作为反映应激的指标，HSPs可以反映运动时细胞内发生变化的情况，这也许对监控过度训练有重要意义[43]。另一方面， HSPs具有细胞保护作用，HSPs有可能在过渡训练或肌肉损伤时对保持肌肉功能起作用。Liu Y et al．[44]在研究人的骨骼肌HSP70时，发现血清CK在训练开始时显著性的增加，但是随着HSP70产生增加CK开始降低。但是迄今为止，还没有关于HSPs表达与运动成绩关系的相关研究，相信这方面的研究将具有重要的生理学意义。

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