精液常用生化检查

第四节 精液常用生化检查

一、精浆果糖测定

精浆中富含果糖，是由血液葡萄糖经精囊转变而来。精浆中果糖是精子能量的主要来源，其含量高低直接影响精子的活力，为精子纤丝收缩提供能量（ATP），主要依靠果糖代谢来补充。近年发现精囊腺对雄性激素的刺激十分敏感，并且精囊果糖的分泌受雄激素的控制，许多学者将人类精浆中果糖含量作为间接反映睾丸间质细胞分泌睾酮功能的指标。

精浆果糖测定的方法较多，主要有间苯二酚化学法、吲哚显色法、果糖脱氢酶法和高效液相层析法等。由于间苯二酚法操作简单，目前常用此法。但此法实测结果要比真实结果偏高，必须引起检验人员的注意。

1．原理

果糖在强酸条件下，与间苯二酚加热后产生红色化合物，与标准管比色即可得出其含量。

2．试剂

（1）0.175mol/L硫酸锌溶液。称取硫酸锌50.3g，溶于1000ml蒸馏水中。

（2）0.15mol/L氢氧化钡溶液。称取氢氧化钡47.5g，溶于1000ml蒸馏水中。

（3）1g/L间苯二酚溶液。称取间苯二酚100mg，溶于95%乙醇100ml中。

（4）10mol/L盐酸溶液。1份蒸馏水加5份浓盐酸。

（5）果糖标准贮存液（30mol/L）。称取果糖（AR）540mg，加2g/L苯甲酸溶液至100ml。

（6）果糖标准应用液（0.3mol/L）。取1ml果糖标准贮存液，加2g/L苯甲酸溶液至100ml。

3．操作方法

取0.1ml精浆加入2.9ml水中，再加0.5ml氢氧化钡液和0.5ml硫酸锌液后混匀，静置5min，离心取上清液按表5-1操作步骤进行。

在90℃水浴中加热10min，然后流水冷却。以空白管调“零”，波长490nm比色，测定各管光密度。

4．计算

精浆果糖（mmol/L）=（测定OD÷标准OD）×12。

5．参考值

精浆果糖浓度＞8.3mmol/L，或一次射精＞13mmol/L。

6．临床意义

在精囊腺发育不全、精囊腺炎所致的不育症患者中，精浆果糖往往降低。因此，精浆果糖含量是诊断男性不育、评价附属腺功能和睾丸内分泌功能的指标之一。

精浆果糖降低见于雄激素分泌不足和精囊炎；精浆果糖为零也可见于先天性精囊缺如，输精管或精囊发育不良所致的无精症及逆行射精；而单纯性输精管阻塞性无精症果糖含量正常。

二、精浆酸性磷酸酶测定

酸性磷酸酶存在于全身各组织细胞中，以前列腺含量最丰富。在正常男性血清中，酸性磷酸酶有2/3来自前列腺。精浆中酸性磷酸酶几乎均来自前列腺。因此测定精浆中酸性磷酸酶含量有助于了解前列腺的功能。

1．原理

酸性磷酸酶在酸性条件分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化成红色醌的衍生物，根据红色深浅即可计算出酶的活性。

2．试剂

（1）2.0mol/L枸橼酸缓冲液（p H4.9）。取枸橼酸42g，溶于800ml水中，用Na OH校正p H4.9（约加1mol/L Na OH溶液376ml），加蒸馏水至1L，氯仿数滴，冰箱内保存。

（2）0.01mol/L磷酸苯二钠基质液。取无水磷酸苯二钠2.18g （如含2分子结晶水，应加2.54g），加水至1000ml。此溶液应迅速煮沸，以消灭微生物，冷却后加氯仿4ml防腐，冰箱保存。

（3）碱性溶液。碳酸氢钠4.2g，4-氨基安替比林0.1g，溶于100ml蒸馏水中，加入0.5mol/LNa OH溶液100ml，混匀。

（4）铁氰化钾溶液。分别称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g，各溶于400ml蒸馏水中，二液混合，加水至1L，棕色瓶暗处保存。

（5）酚标准贮存液（1g/L）。称酚（AR）1g于0.1mol/LHCI溶液中，并用此溶液稀释至1L。

（6）酚标准应用液（0.05g/L）。准确吸取酚标准贮存液5ml，于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。

3．操作方法

将精浆用等量盐水稀释1000倍后，按表5-2操作。

波长510nm，以蒸馏水调“零”，读取各管吸光度。

4．结果计算

以测定管吸光度—对照管吸光度，查标准曲线球酶活力。标准曲线制备法见表5-3。(https://www.daowen.com)

立即充分混匀，波长510nm，0号管调零点，读取各管吸光度。以1～5管所得读数与其相应的酸性磷酸酶单位（依次为100U，200U，300U，400U，500U）在坐标纸上作图，绘成标准曲线。

酶单位定义：每毫升精浆在37℃与基质作用15min，产生1mg酚者为1U。

5．正常参考值

正常精浆酸性磷酸酶活力为48.8～208.6U/ml。

6．临床意义

前列腺炎时，精浆中酸性磷酸酶含量下降，当酸性磷酸酶增高时，对前列腺疾病（早期前列腺癌或良性前列腺肥大）有诊断价值，酸性磷酸酶活性显著增高，对于诊断前列腺癌有重要意义。

7．临床经验

标本中酸性磷酸酶极易破坏，故留标本后应及时测定；基质中不应含酚，如含酚时空白管显红色，说明磷酸苯二钠已开始分解，此种基质不宜再用。

三、精子顶体酶测定

1．原理

在25℃、p H8.7条件下，采用ADH/NAD+反应测定苯甲酰精氨酸乙酯（BAEE）的水解产物乙醇，乙醇又在乙醇脱氢酶（ADH）的催化作用下，将辅酶Ⅰ（NAD）还原为还原性辅酶Ⅰ（NADH），根据NADH吸光度的变化值而得出精子顶体酶的水解活性。

2．试剂

（1）2%醋酸溶液。

（2）0.05mol/L的Tris-HCI缓冲液（p H8.7）。取0.1M三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液500ml，加入0.1N盐酸溶液103ml混合后，加蒸馏水至1000ml，4℃保存。

（3）BAEE溶液。用Tris-HCI缓冲液配制1g/L的BAEE溶液10ml，4℃保存。

（4）ADH溶液：用Tris-HCI缓冲液配制3.46g/L的ADH溶液，4℃保存。

（5）NAD溶液：Tris-HCI缓冲液配制20g/L的NAD溶液， 4℃保存。

3．方法

（1）精子内顶体酶的抽提过程。取完全液化的精液0.25ml，在800G条件下离心10min，弃掉精浆；用生理盐水5ml洗涤精子3次，以洗掉残存的精浆，弃掉上清液后将离心管在吸水纸上倒置，这样可以吸干所有的洗涤溶液。在精子沉淀物中加入醋酸溶液0.25ml，在4℃环境下提取16～24h，然后在＞1200G条件下离心10min，上清液留待进行顶体酶的测定。

（2）测定过程。按表5-4进行操作。

立即混匀，放入25℃水浴10min，在340nm波长下测定吸光度的变化值。

（3）酶活力单位的定义和酶活力的计算。1个毫单位（m U）的顶体酶在上述反应条件下，每分钟水解1nmol BAEE所需的顶体酶量。

因为水解1nmol的BAEE使反应液吸光度变化0.0011 （366nm/min），所以每毫升精液内的酶活力按下列公式计算：

酶活力（m U/ml）=△A÷（t×0.0011×v）=△A÷0.011×20

4．临床意义

正常生育男性精子顶体酶活性为36.72±21.43m U/ml。顶体酶存在于精子顶体体内的一种类胰蛋白，此酶能水解卵细胞的透明带，使精子能够与卵细胞融合，还能增强精子的活力和促进精子的运动。由此可见顶体酶对于精子的运动和受精过程都是不可缺少的，顶体酶活力不足可导致男性不育。

5．临床经验

（1）NAD溶液、BAEE溶液、ADH溶液需要新鲜配制。

（2）加酶提取液时动作要快，以免造成时间过长，影响试验结果。

四、精子低渗肿胀试验（HOS）

精子低渗肿胀试验简称为HOS，是目前不多的几个评价精子膜功能的检测方法之一，被越来越广泛地应用于男性不育症的临床诊治和研究当中。精子代表了男性的生殖能力，而对于一个精子而言，其精子膜的功能十分重要，与精子获能、顶体反应、精卵融合等生殖过程有直接联系。采用HOS就可评价精子膜功能的完整性，该方法简便、经济而可靠。

1．试剂

膨胀液：枸橼酸钠0.735g，果糖1.351g，加蒸馏水至100ml。分装，-20℃冷冻保存，使用前解冻，并充分混匀。

2．操作

（1）取小试管，加1ml膨胀液，37℃预温5min。

（2）加0.1ml液化精液，轻轻混匀，在37℃孵育至少30min。

（3）在相差显微镜下观察精子，膨胀精子为尾部形状发生变化的精子，即活精子。计数200个精子，计算膨胀精子的百分率。

3．参考区间

在排精30～60min内，HOS≥60%，为正常，说明60%以上精子出现尾部膨胀；HOS在50%～59%，属正常与异常之间；HOS＜50%，为异常。