第2节 骨微环境与肿瘤的关系
骨骼是实体肿瘤转移的靶器官之一。据统计，约有20%的肿瘤患者会发生骨转移。常见的以骨为转移靶器官的肿瘤有乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肾癌以及甲状腺癌等，其中乳腺癌和前列腺癌最终发生骨转移率高达70%。众所周知，在骨生理微环境中，成骨细胞和破骨细胞共同参与维持骨质代谢的平衡。肿瘤细胞发生骨转移的步骤非常复杂，原位肿瘤细胞通过分泌细胞因子和外泌体，改造骨微环境并形成适合肿瘤细胞转移和生长的巢穴；转移到骨的肿瘤细胞经过休眠期后利用正常骨代谢促进自身快速生长，并与之形成复杂的微环境。在这样一个相对封闭而又充满丰富营养供给的环境里，多细胞之间发生相互作用，形成恶性循环。
一、 肿瘤骨转移概论
肿瘤由原发灶部位转移到骨，并且产生骨质破坏，这要经历非常复杂的过程。首先，肿瘤细胞在原发灶部位由于基因突变、细胞特性改变等逐渐向恶性转化，具备了改造骨微环境和迁移侵袭的能力，在骨微环境中形成适合肿瘤细胞定向转移到骨微环境中的巢穴；其次，原发灶肿瘤细胞进入循环系统，通过血流及骨倾向性相关细胞因子的吸引机制，实现在骨的定位、增殖，形成转移灶。由于肿瘤本身的特性，表达和分泌很多与骨微环境细胞相互影响的受体、细胞因子、趋化因子等，经过成骨细胞、破骨细胞的相互作用，使正常的骨质平衡被破坏，最终导致骨过多形成或骨丢失，从而产生骨损伤。
关于肿瘤转移的分子机制，19世纪英国Paget提出的“土壤和种子”学说已得到广泛认可。该学说认为，肿瘤细胞通过血液等途径播散，倾向性停留在靶器官并形成转移灶。目前许多研究证据表明，一些肿瘤细胞在原位时就具备了分泌细胞因子及外泌体的能力，使特定的“土壤”形成适合将要转移过来的肿瘤细胞生长，即在骨微环境中形成巢穴-肿瘤转移前微环境（premetastatic niches）。这种改变注定该肿瘤细胞将特定转移到骨器官。肿瘤转移取决于微环境提供的适宜“土壤”和肿瘤细胞对微环境的适应能力，靶器官适宜的微环境是肿瘤发生转移的必要条件。
关于肿瘤骨倾向性的分子机制，已有充分的研究证明，肿瘤细胞高表达G蛋白偶联受体趋化因子受体4（CXCR4），其配体基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1, SDF-1）在骨髓中大量存在，肿瘤细胞在SDF-1的吸引下，倾向性地进入到骨微环境中。CXCR4和其他骨转移相关因子一起，如白细胞介素（IL）-11、组织细胞生长因子（CTGF）、骨桥蛋白（OPN）、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）增强了乳腺癌细胞系的骨转移能力。在调节骨倾向性的分子中，整合素类也发挥了很大的作用。如整合素α2β1，作为Ⅰ型胶原的受体，通过增强前列腺癌细胞和骨基质蛋白的结合，从而促进肿瘤细胞对骨的黏附，提高了骨转移的效率。同时，肿瘤细胞也会发生一些骨倾向性改变。研究者发现，发生骨转移的肿瘤细胞会逐渐表现出部分与骨细胞相似的特点，这一现象被称为骨拟态（mimicry of bone tumor）。骨拟态能够促进肿瘤细胞向骨的运动、黏附、增殖和存活。有意思的是，研究发现肿瘤细胞骨拟态的特征更多地相似于成骨细胞，如调节成骨细胞分化以及诱导骨蛋白表达的重要转录因子Runx2、MSX2等被显著地上调表达。肿瘤细胞发生骨拟态后显著表达一系列的骨蛋白，包括骨桥蛋白（osteopontin）、骨钙蛋白（osteocalcin）、骨粘连蛋白（osteonectin）以及骨唾液蛋白Ⅱ（bone sialoprotein Ⅱ）等。
当肿瘤细胞转移至骨微环境中并经过一段时期的休眠后，部分肿瘤细胞开始生长。肿瘤细胞分泌大量的细胞因子，这些细胞因子一方面可以直接刺激破骨细胞活化，另一方面通过刺激成骨细胞改变其破骨细胞活化因子RANKL/OPG的分泌比例，也使得破骨细胞被大量活化。剧烈活化的破骨细胞导致大量的骨吸收，从而形成溶骨性损伤，而此时原本保存在骨基质中的一些生长因子如转化生长因子-β（transforming growth factor beta, TGF-β）、胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor 1, IGF-1）和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）等由于骨质的破坏而大量释放。释放的这些生长因子反过来又能刺激肿瘤细胞的生长和迁移，导致其进一步恶化。这就是所谓的“恶性循环”（vicious cycle）。肿瘤细胞打破骨环境中原有的生理平衡，对骨骼产生了破坏作用。根据肿瘤骨转移对骨骼产生的影响，将骨转移分为3类：溶骨性骨转移、成骨性骨转移以及混合性骨转移。
二、 成骨性骨转移的分子机制
成骨性骨转移，顾名思义，即肿瘤细胞转移到骨后导致骨生成增加。代表性肿瘤为前列腺癌。前列腺癌发生骨转移的概率高达68%；肿瘤细胞转移到骨后和骨微环境相互作用的结果表现为使骨量增加。
在成骨性骨转移过程中，肿瘤细胞表达出大量促进骨生成的细胞因子。比如血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）、IGF、肾上 腺髓质素（adrenomedullin）等参与了成骨性骨转移的调节。研究发现，在成骨性骨转移中内皮素-1（endothelin-1, ET-1）起到了促进新骨形成的作用。ET-1是肿瘤细胞分泌的又一个重要细胞分子，通过与成骨细胞上表达ET-1的受体，即ETAR（endothelin A receptor）结合，促使成骨细胞中一系列的基因表达上调，其中包括分泌蛋白IL-6、 Wnt5a、TIMP-3、Cyr61、CTGF、RANKL、信号分 子SGK、转录因子TSC-22、C/EBPδ、TGIF和Twist 等。这些基因中如IL-6、Wnt5a、TIMP-3、Cyr61、CTGF、RANKL、TGIF等已经被实验证实参与了成骨性骨转移的调节。值得注意的是，Wnt信号通路早已被报道是对正常成骨细胞分化和功能调节非常重要的信号通路。然而无独有偶，ET-1在成骨细胞中显著地下调了Dkk1，后者是Wnt信号通路的负调控者。研究发现Dkk1能够显著地抑制由ET-1刺激引起的成骨细胞增殖与分化，因此ET-1显然是成骨性骨转移的重要调控者，一方面上调促进成骨的相关基因，另一方面下调成骨形成的负调控基因。
调节成骨性骨转移中成骨细胞功能的另一个重要因子是甲状旁腺相关蛋白（parathyroid hormonerelated protein, PTHrP）。PTHrP在溶骨性骨转移中与TGF-β一起形成了调节溶骨性骨损伤的“恶性循环”。研究表明，在前列腺癌中往往伴随着PTHrP的丰富表达，虽然这在成骨性骨转移过程中显得有些矛盾，但在进一步的研究中发现，这与PTHrP蛋白合成分泌后的不同剪切有关。当PTHrP剪切形式为氨基酸1～16位氨基酸残基时能够刺激成骨细胞分化，生成新骨。将序列细分发现，PTHrP的1～20位氨基酸残基以及1～23位氨基酸残基都能具备促进成骨细胞分化的作用，而当是1～34位时则主要表现为促进溶骨性作用。通过序列分析对比，PTHrP氨基酸8～11的残基是LHDK，而ET-1的6～9位氨基酸残基是LMDK，二者具有极高的序列相似性。提示这段序列可能与ETAR结合并激活了其信号通路。事实上，PTHrP介导的促成骨细胞功能特异的被ETAR的抗体或者拮抗剂所抑制，表明PTHrP这段剪切多肽作为ETAR的激动剂而发挥功能。不仅如此，进一步生化分析显示PTHrP的这段序列和ET-1在激动ETAR的效率上几乎相当。前列腺特异抗原（prostate specific antigen, PSA）是一个丝氨酸蛋白酶，它在PTHrP剪切中发挥作用。PSA在PTHrP的23位氨基酸残基切割，导致PTHrP不能激活其在破骨细胞上的经典受体PTHrP受体，同时产生能够激动ETAR的多肽片段。因此PSA和PTHrP也是前列腺癌成骨性骨破坏的重要分子（图2-1）。
图2-1 肿瘤成骨性骨转移的分子机制(https://www.daowen.com)
肿瘤细胞分泌产生诸多信号分子，如ET-1、IGF、BMP、PDGF等，它们直接能够调节成骨细胞的活性，促进成骨细胞分化。ET-1同时能够抑制成骨细胞Dkk1的表达，进一步协同扩大Wnt信号通路对成骨细胞功能的调节。PSA作为水解酶，能够切割PTHrP产生激动ETAR的肽片段，从而促进成骨细胞分化［修改自Clines G A, Guise T A. Molecular mechanisms and treatment of bone metastases. Expert Rev Mol Med, 2008, 3(06): 10］
尽管定义上表明成骨性骨转移导致骨生成增加，但这不单单局限于成骨细胞自身，实际上也是骨吸收和骨生成共同作用的结果。有研究表明破骨细胞在这个过程中也发挥重要作用。在成骨性骨转移肿瘤中，骨吸收也发挥着重要作用。明显的证据是在成骨性转移中，抵抗溶骨性骨吸收的双膦酸盐药物能够显著地减少相应的骨并发症。
三、 溶骨性骨转移的分子机制
溶骨性骨转移导致骨溶解，其代表性肿瘤就是乳腺癌，肿瘤细胞通过直接或间接作用使破骨细胞过度活化，导致异常的骨破坏与吸收。
在骨微环境中，破骨细胞和成骨细胞是相互作用的，成骨细胞通过旁分泌的细胞因子受体激活核因子-κB配体（receptor activator of nuclear factorκB ligand, RANKL）以及它的诱饵受体骨保护素（osteoprotegerin, OPG）来调节破骨细胞的分化。RANKL为促进破骨细胞分化的细胞因子，可以结合其存在于破骨细胞表面的受体刺激破骨细胞的成熟。OPG竞争性结合RANKL并阻止破骨细胞的 激活。
肿瘤细胞可以产生一些细胞因子直接作用于破骨细胞诱导破骨细胞的活化，或间接地促进破骨细胞骨吸收。肿瘤细胞分泌的细胞因子PTHrP、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）、IL-1β、IL-6、IL-11可以直接刺激成骨细胞上调RANKL/OPG的比例，间接促进破骨细胞的活化。同时，肿瘤细胞分泌的细胞因子TNF-α、IL-1β可以直接作用在破骨细胞，促进破骨细胞的分化。破骨细胞的过度活化导致骨质溶解的过程中使储存在骨质中的生长因子TGF-β、IGF、EGF等释放出来，这些细胞因子又会反作用于肿瘤细胞，进一步促进肿瘤细胞的生长并释放大量的破骨细胞活化因子，因此形成“恶性循环”（图2-2）。乳腺癌骨转移灶PTHrP表达（92%）比原位肿瘤（50%）或非骨转移（17%）的患者高，这些临床观察也在小鼠模型中得到了证实，用PTHrP的抗体中和之后可以明显降低乳腺癌相关骨转移的发生。
四、 展望
图2-2 肿瘤骨转移机制示意图
a. 肿瘤分泌细胞因子和外泌体，在骨微环境中形成“巢穴”；b. 肿瘤细胞迁移，通过淋巴、血液系统特定转移到骨；c. 肿瘤细胞继续改造骨微环境，利用正常骨代谢促进自身生长，导致骨损伤，骨破坏过程释放生长因子，促进肿瘤细胞快速增殖，形成恶性循环
乳腺癌和前列腺癌是容易发生骨转移的肿瘤，肿瘤细胞转移到骨后，利用正常的骨代谢以促使自身大量增殖，癌细胞分泌的细胞因子可以从依赖RANKL-RANK轴和不依赖RANKL-RANK轴两种途径促进成骨细胞和破骨细胞的活化而形成骨损伤。骨破坏过程中释放大量的TGF-β、BMP和IGF-1，又反作用到肿瘤细胞，诱导新一轮的破骨细胞活化因子产生，因此形成了无限放大的恶性循环。
癌症骨转移会直接破坏骨结构，引起剧烈的疼痛、神经压迫及血钙过多，进而加速癌症患者死亡。与其他癌症相比，目前只有很少的药物可以有效地治疗癌症骨转移。临床上针对骨转移最常用的药物是双膦酸盐。双膦酸盐只靶向于破骨细胞。另一个治疗骨转移的药物为狄诺塞麦（denosumab）。狄诺塞麦是人源破骨细胞活化因子RANKL的单抗，通过靶向于破骨细胞，抑制破骨细胞活性而治疗肿瘤骨转移。研究肿瘤细胞与骨微环境之间的关系，发现新的分子靶点能阻断肿瘤细胞和骨微环境之间的恶性循环，对于治疗肿瘤骨转移具有非常重要的意义。