第3节 关键蛋白在骨肿瘤中作用的研究进展
蛋白质功能的失调在肿瘤的发生和发展中有着不可替代的作用，癌症发生关键蛋白的鉴定及其分子机制的研究无疑将会对肿瘤的诊断、药物靶点的开发等提供重要的理论基础。近年来，随着基因测序、全基因组筛选、临床样本分析以及动物模型的研究，越来越多的骨肿瘤关键蛋白被相继报道，为骨肿瘤的诊断和治疗提供了有效的分子检测靶点。本节我们将着重介绍常见原发性骨肿瘤中的关键蛋白，以期为此类肿瘤的诊断、治疗和药物开发提供帮助。
一、 骨肉瘤中的关键蛋白
骨肉瘤是常见的原发性骨肿瘤之一，位列儿童和青少年常见癌症的第三位。骨肉瘤以长骨的间充质细胞形成梭形细胞和类骨质为病理学变化特征，其恶性程度很高，可占恶性骨肿瘤的20%～45%。在过去的30年中，其治疗的方案没有太多的改变，主要是以肿瘤切除和非特异性结合的化疗为主。骨肉瘤的发生往往伴随着全基因组和肿瘤基因的扩增和突变，是最无序的癌症之一。许多骨肉瘤相关的驱动基因被鉴定，但现在被验证的只有TP53、Rb1、CDKN2A、MYC以及DNA解旋酶Recq等，这些基因的功能涉及细胞周期的调控、代谢的调控、细胞的分化、蛋白质的降解、转运及细胞信号转导等。我们将在以下分别阐述相应基因的功能。
（一） GWAS的数据分析
基因组测序技术的发展为深入了解骨肉瘤的遗传学改变提供了良好的技术支持。第一次大规模的全基因组关联研究（genome-wide association study, GWAS）筛查发现了骨肿瘤的易感基因，即谷氨酸受体GRM4（6p21.3），该基因参与调控cAMP以及谷氨酸的信号通路，而这两条信号通路的失调与骨肿瘤的发生密切相关。同时，研究已经发现谷氨酸的离子型受体GRIK4以及cAMP依赖的磷酸激酶Prkar1a都可以参与调控骨肉瘤的发生，这也进一步支持了谷氨酸信号途径在骨肉瘤发生中的作用。
（二） 体细胞突变的关键蛋白
稀有性、基因组的复杂性以及肿瘤的异质性，对骨肉瘤分子表征的鉴定提出了巨大的挑战。其中TP53与RB1基因的突变是目前在骨肉瘤中报道最多的，其突变率分别为80%～90%与10%～39%。最值得注意的一点是，TP53的基因突变主要发生在第一个外显子中。另外在骨肉瘤中常见的关键蛋白还包括DNA解旋酶Recq以及Runx2等。研究还发现，在骨肉瘤中端粒的过度延长十分常见，主要负责抑制端粒缩短和衰老的替代延长端粒酶ALT蛋白在骨肉瘤中存在突变，并且与骨肉瘤患者的预后密切 相关。
（三） 表观遗传修饰关键蛋白
在骨肉瘤中，许多基因启动子区有过度的甲基化，同时组蛋白修饰的相关基因HDAC等也已经被报道与骨肉瘤的发生密切相关，因此表观遗传修饰无疑对骨肿瘤的发生有着重要的作用。与此相对应的是，DNA去甲基化以及乙酰化的抑制剂已经逐步用于抗辐射的骨肉瘤的治疗中，进行了一期和二期的临床实验。
（四） 信号通路中的关键蛋白
Hedgehog、Wnt、Notch等信号通路在正常的骨发育中有着重要的作用，而这些信号通路与骨肉瘤的发生也密切相关。其中Hedgehog信号通路中的PTCH1、GLI以及Notch通路的Notch1、Notch2、Notch3在骨肉瘤中高表达。Wnt信号通路的抑制因子DKK3以及WIF1的表达量在骨肉瘤中明显地 下降。
1. 受体酪氨酸激酶 已经发现，许多受体酪氨酸激酶及其受体包括血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、IGF-1、PDGF、人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）、Met［也称HGFR（hepatocyte growth factor receptor）］等都发现在骨肉瘤中高表达，而它们相应的靶向药物也已经用于骨肉瘤的治疗中。
2. 磷酸激酶 激酶信号通路的过度激活与癌症的治疗密切相关。其中Src、mTOR以及Aurora A、B、C已有报道在骨肿瘤中过度激活，而Src的抑制剂（AZD0530）、mTOR的抑制剂（ridaforolimus）以及Aurora的靶向药物VX-680及ZM447439已经用于临床的实验中。
3. 新鉴定的关键蛋白 为了进一步鉴定骨肉瘤的驱动基因，许多课题组做了其他的尝试。Khokha利用睡美人系统发现了新的关键蛋白，涉及Erb2、PI3K-AKT-mTOR以及MAPK信号通路。该系统除了发现TP53、Myc这些已知的蛋白外，还发现了Nrf1、Nrf2、Sema4d、Sema6d等新的蛋白参与调控骨肉瘤的发生。
二、 骨巨细胞瘤中的关键蛋白
骨巨细胞瘤是一类较为稀有的骨肿瘤，主要由3种细胞组成：巨细胞、单核细胞以及基质 细胞。
（一） RANKL信号通路
在骨相关的疾病中，许多的病理状态都是由于RANKL/OPG比例失调造成的。2000年，有课题组通过RT-PCR以及原位杂交的实验方法，发现RANKL以及其受体RANK在骨巨细胞瘤中高表达；2002年，Roux等用免疫染色的方式鉴定了其在蛋白水平的过表达。这些研究都表明，RANK、RANKL在骨巨细胞瘤的发生中有重要的作用。RANKL在基质细胞中的过表达对于此类肿瘤中大量破骨细胞的形成有重要的作用。
（二） 集落刺激因子1（CSF1）
骨巨细胞瘤的发生往往与破骨细胞过度活化相关。CSF-1基因在许多腱鞘巨细胞瘤中过表达。新英格兰的药理学杂志报道，CSF-1的受体CSFR-1的选择性抑制剂PLX3397可以用于临床的腱鞘巨细胞瘤的治疗，有良好的预后效果。
（三） 新的关键蛋白
随着对骨巨细胞瘤研究的深入，许多与骨巨细胞瘤发生相关的新关键蛋白被逐一鉴定。Amary等通过基因组的测序发现了新的驱动基因H3F3。其中，H3F3A的G24A和G34L突变占所测肿瘤的92%，而H3F3B的G34R的突变占10%左右。值得注意的是，这些突变主要存在于骨巨细胞瘤的基质细胞中，而鲜少存在于骨巨细胞中。这些都提示H3F3A以及H3F3B的突变可能通过改变破骨细胞的招募，进而影响骨巨细胞瘤的发生。但是对于其中的分子机制我们并不是十分清楚，它可能通过改变RANKL或者是CSF-1的表达来影响骨巨细胞瘤的发生。
三、 多发性骨髓瘤中的关键蛋白
多发性骨髓瘤的特点是恶性浆细胞在骨髓中的浸润，在患者的血中可检测到过量的M蛋白，造成患者的溶骨性的病变、贫血、高钙血症以及肾功能的损害。目前以分子生物学为基础的转化医学研究有可能在多发性骨髓瘤的治疗中有着非常好的前景。这主要基于两个方面：① 分子遗传学、基因组学以及蛋白质组学的研究，为了解多发性骨髓瘤的发病机制、潜在靶点的确定，以及将来以增加肿瘤细胞的细胞毒作用，减少非特异性细胞毒作用和克服传统的耐药性的靶向治疗，提供了重要的基础。② 随着对于多发性骨髓瘤肿瘤微环境的研究，更清楚地认识到多发性骨髓瘤细胞对于骨髓的黏附，会进一步影响到骨髓间充质干细胞的基因表达，从而增加肿瘤的生长、生存、耐药性和在骨髓环境中的迁移。下面我们将着重介绍多发性骨髓瘤中的关键蛋白。(https://www.daowen.com)
（一） Cyclin蛋白
多发性骨髓瘤中，其基因组极为不稳定，染色体的异位和基因的突变经常造成基因功能的缺失或者过度激活。其中有两个位置的突变可以引起Cyclin蛋白的过表达：① 基因组的t（11；14）（q13；q32）的异位，在多发性骨髓瘤中发生的概率为15%～20%，引起Cyclin D1的过表达；② t（6；14）（p21；q32）的异位，存在于15%的多发性骨髓瘤细胞中，引起Cyclin D3的过表达。Cyclin蛋白的过表达往往引起细胞周期的改变，造成细胞的过度增殖。
（二） WHSC1蛋白
WHSC1是一类组蛋白的甲基化转移酶，可以影响基因组的表观遗传修饰。研究发现，约有15%的多发性骨髓瘤中WHSC1基因表达失调。
（三） 新的关键蛋白
aGCH与基因表达谱的分析发现了一些新的与多发性骨髓瘤发生相关的蛋白。这其中包括许多的抑癌基因，包括TP53、PTEN的突变以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白CDKN2A以及CDKN2C等，这些都提示许多抑癌基因在多发性骨髓瘤中有重要的作用。
另外，约有10%的患者存在激活突变的FGF3；更重要的是RAS家族的两个成员NRAS、KRAS在密码子的12、13和61位存在突变，其在多发性骨髓瘤中的突变概率为40%～55%。这些都说明MAPK信号通路在多发性骨髓瘤的发生和发展中有重要的作用。
四、 脊索瘤中的关键蛋白
脊索瘤是一种罕见的骨肿瘤，但侵袭性较高，预后较差，复发率较高。Virchow在1857年第一次发现脊索瘤的病例；1890年，Ribbert提出了脊索瘤起源于幼年脊索的假说。研究发现，在脊索瘤中有许多与胚胎的脊索细胞巢相关蛋白的高表达。虽然没有直接证据表明脊索瘤起源于胚胎时期的脊索，但是相同的分子表达谱提示它们很大程度上是由脊索转分化来的。最值得信服的能够支持脊索假设的证据是：在一类家族性的脊索瘤中发现了转录因子Brachyury的过表达，而这一转录因子主要表达在正常未分化的胚胎时期的脊索中。在许多其他的癌症中，Brachyury会影响上皮细胞间质化（EMT），但是Brachyury影响脊索瘤发生的具体原因还不是十分清楚。
脊索瘤分子生物学分析发现，血小板性生长因子受体PDGFRB、PDGFRA以及Kit的受体高表达。在2004年和2009年，分别有文章报道了脊索瘤患者对靶向PDGFR和Kit的药物伊马替尼（imatinib）的响应。
随着研究的深入，新的关键蛋白也被进一步鉴定，例如在12例的脊索瘤病例中发现了表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）和c-Met的过表达。同时通过对70例临床样本的分析发现，信号传导及转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3, STAT3）的磷酸化水平有明显的提高。STAT3蛋白的过度激活已经表明与许多肿瘤的发生和预后密切相关，而且STAT3的抑制剂可以抑制脊索瘤的生长。
五、 软骨肉瘤中的关键蛋白
软骨肉瘤可以分为常规型和变异类型。变异类型的软骨肉瘤又可以分为3种，包括透明细胞型软骨肉瘤、间充质样软骨肉瘤和去分化较差的软骨肉瘤。以下将分别对这几类软骨肉瘤中的关键蛋白进行介绍。
（一） 常规型软骨肉瘤
EXT基因参与合成硫酸乙酰肝素硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG），是细胞信号转导的基本物质之一。研究表明，EXT1与EXT2基因的失活对于原发性和继发性软骨肉瘤的发生和发展至关重要，但是其中具体的分子机制并不十分清楚。
许多在骨骼的发育中激活的信号通路，如Ihh、PTHLH、TGF-β、Wnt信号通路在软骨肉瘤的发生中有重要的作用。其中Ihh以及Wnt信号通路的活性在软骨肉瘤中下降，但是TGF-β以及PTHLH信号通路由于对软骨肉瘤的增殖有重要的作用，因此在软骨肉瘤中是过度活化的。
（二） 变异型软骨肉瘤
透明细胞型软骨肉瘤的预后较好。有研究表明，第20位染色体的重排以及9q的丢失与透明细胞型软骨肉瘤的发病密切相关。而且PTHLH、PDGFIHH、Runt相关的转录因子以及MMP2在透明细胞型软骨肉瘤中高表达。
间充质样软骨肉瘤的预后较差。该肿瘤在青年中的发病率较高。在约60%的间充质样软骨肉瘤中发现有P53的过表达。同时，抗凋亡的分子BCL2、PDGFR以及PKC在此类肿瘤中也存在过表达。
去分化较差的软骨肉瘤是一类预后极差的骨肉瘤，其主要特征是具有普通的软骨肉瘤和非软骨未分化的肉瘤。基因组测序表明，H-Ras基因的外显子的12和13位在此类软骨肉瘤中存在突变，HRas突变肿瘤的预后比未突变的患者预后差，这些证明H-Ras在去分化较差的软骨肉瘤发生中有重要的 作用。
六、 展望
在骨肿瘤的研究中，骨肉瘤、多发性骨髓瘤以及骨巨细胞瘤的关键蛋白的阐释较多，主要涉及抑癌基因p53、PTEN，以及信号通路的过度激活。将来我们还需要扩大临床的样本分析，利用生化和动物模型研究此类蛋白在骨肿瘤中发病的具体分子机制，为将来药物的治疗提供理论基础。同时，值得注意的是，在骨肿瘤中，VEGF、IGF-1、PDGF、HER2、MET等细胞表面受体有过量的表达，造成其信号通路的过度活化，引起肿瘤的过度增殖。这些蛋白的具体分子机制已经在肺癌、乳腺癌、结肠癌中有非常深入的研究，并且有许多的抑制剂已经用于癌症的治疗中。在以后的研究中，我们可以借鉴其他癌症研究的经验，详细阐述表面受体的过度激活对于骨肿瘤发生的具体作用。
近几年，基因编辑技术发展迅速，CRISPR/Cas9技术被用于许多遗传性疾病的基因修复中。我们发现在骨肿瘤，许多关键蛋白都存在过表达或者是基因的过度活化，我们也可尝试在骨肿瘤中利用基因编辑手段，对某些关键基因进行修复以求达到治疗骨肿瘤的目的。
随着测序技术以及蛋白质组学等新技术的发展，新的与骨肿瘤发生相关的关键蛋白将进一步被鉴定，关键蛋白的图谱将不断被完善，而这些关键蛋白的鉴定无疑将对骨肿瘤的诊断和治疗提供了必不可少的理论基础，将为药物的开发提供坚实的后盾。