Runx2基因突变小鼠模型建立

Runx2纯合突变的小鼠因呼吸衰竭死亡。为了干扰Runx2表达，将PGK-neo替代其外显子1(1.2kb)，该部位含Runt结构域上的前41个氨基酸。为了构建基因打靶载体，将基因组ClaI-BglII片段 (2.3kb)克隆至pBluescript SKs上的ClaI-BamHI位点。将含有PGK-neo平滑末端的EcoRI-BglII片段连接到XbaI位点上。为得到最终的目标载体，基因组BstEII-ClaI(1.3 kb)片段经钝性连接到NotI末端。基因组 SalI-ClaI(11.2 kb)片段插入到pBluescript SK［含有基因组ClaI-BglII(2.3kb)片段、PGKHSV-tk及PGK-neo］的SalI-ClaI部分。载体经电转入胚胎干细胞(E14)培养，并筛选克隆 (按照Komori等所述)，选出的克隆用BamHI剪切含ClaI-SalI片段的基因组DNA探针经Southern blot验证。突变的胚胎干细胞克隆注入C57BL/6J囊胚中，转移至假孕的ICR雌性小鼠，所得子代小鼠再与C57BL/6J小鼠杂交，得到杂合小鼠经基因组Southern blot鉴定。通过对Runt区域做RTPCR鉴定，Runx2基因表达受到干扰。