2.1.6 免疫组化及染色
2.1.6.1果蝇幼虫成虫盘的解剖
成虫盘（imaginal disc）是果蝇幼虫发育过程中形成的未分化的细胞团，不同的成虫盘会在变态期后分别发育分化为腿、翅膀、触角及眼等成体器官（图2-4）。我们实验所用的成虫盘均解剖自晚期三龄幼虫（在25℃条件下培养至产卵后108～120h）。
果蝇眼成虫盘解剖步骤如下：
（1）在解剖盘（由硅胶与黑墨水混合制成）中倒入适量PBS（购自生工），置于显微镜下；
图2-4 果蝇幼虫成虫盘及对应成体器官示意图[2]
（2）用镊子小心挑取指定基因型的三龄幼虫置于解剖盘中；
（3）用两把镊子分别夹住幼虫的中部及前端嘴钩（mouth hooks），沿着箭头方向用力拉扯嘴钩，丢弃幼虫后半部及多余的脂肪、肠等组织（图2-5）；
图2-5 三龄幼虫眼成虫盘解剖示意图
（4）将解剖出的组织置于冰上并加入PBS的离心管中；
（5）根据实验需要用不同方法进行后续试验（见下一节）。
解剖翅成虫盘步骤类似，用两把镊子将幼虫由中间截断，将有嘴钩的前半段由内向外翻出，将体内组织器官暴露在外，小心去除多余脂肪及肠等组织后，放入装有PBS的离心管中。
2.1.6.2 AO染色
吖啶橙（acridine orange，AO）是一种荧光染料，它能够嵌入单链的DNA或者RNA上并发出荧光。凋亡或死亡的细胞中DNA会发生断裂，使AO能够嵌入核中的DNA上，因此AO染色可以用来检测细胞死亡[96]。
果蝇成虫盘AO染色步骤如下：
（1）将解剖好的组织加入到含有1×10-6mol AO的1×PBS中。
（2）室温避光染色5min；
（3）用PBS漂洗3次；
（4）用光学显微镜在载玻片上迅速解剖分理出所需组织；
（5）制片并用荧光显微镜拍照。
2.1.6.3抗体染色
果蝇成虫盘抗体染色步骤如下：
（1）将解剖好的组织用新鲜配制的4%甲醛室温固定20min；
（2）用加入0.3%Tween的PBS清洗3次，每次5min；
（3）加入5%马血清，封闭1h；
（4）在0.6m L的管中加入一抗染色，4℃摇床过夜；
（5）用加入0.3%Triton的PBS清洗3次，每次15min；
（6）加入二抗室温避光染色2h；
（7）加入0.3%Tween的PBS避光清洗3次，每次15min；
（8）用光学显微镜在载玻片上迅速解剖分理出所需组织，滴上含有DAPI（4′，6-diamidino-2-phenylindole）的封片液，制成装片，用荧光显微镜进行拍摄。
本文中所用一抗：rabbit anti-phospho-JNK（1∶200，Calbiochem），mouse anti-MMP1（1∶200，Developmental Studies Hybridoma Bank，DSHB），mouse anti-β-Gal（1∶1000，DSHB），mouse anti-Wg（1∶300，DSHB），rabbit anti-PH3（1∶100，Cell Signaling Technology，CST），rabbit anti-active Caspase 3（1∶400，CST），Rat anti-CycE（受赠于HE Richardson，1∶200），rat anti-E-cad（1∶20，DSHB）.(https://www.daowen.com)
本文中所用二抗：anti-rabbit-Alexa（1∶1000，CST），anti-mouse-Cy3（1∶1 000，Jackson Immuno Research），anti-Rat-Cy3（1∶1000，Jackson Immuno Research）.
2.1.6.4 F-肌动蛋白（actin）染色
果蝇翅成虫盘F-肌动蛋白染色步骤如下：
（1）将解剖好的组织用新鲜配制的4%甲醛室温固定20min；
（2）用PBS清洗3次，每次5min；
（3）加入1∶20稀释的Alexa Fluor 555标记的鬼笔环肽（phalloidin）；
（4）避光室温染色15min；
（5）用PBS清洗一次；
（6）用光学显微镜在载玻片上迅速解剖分理出所需组织，滴上含有DAPI（4′，6-diamidino-2-phenylindole）的封片液，制成装片，用荧光显微镜进行拍摄。
2.1.6.5 X-Gal染色
X-Gal是β-半乳糖苷酶的底物，在其催化下水解后生成蓝色产物，研究人员将含有编码LacZ基因的片段插入到果蝇特定基因内，这样LacZ的表达就代表了该基因转录，进而可通过X-Gal染色反映出该基因在体内的转录激活情况。
果蝇成虫盘X-Gal染色步骤如下：
（1）配制溶液A（1×PBST+150mmol NaCl+1mmol MgCl2）；
（2）将解剖好的组织用含有1%戊二醛的溶液A室温固定15min；
（3）用含有3.3mmol K 3Fe（CN）6及3.3mmol K3Fe（CN）6·3H 2O的溶液A清洗一次；
（4）在含有3.3mmol K 3Fe（CN）6及3.3mmol K3Fe（CN）6·3H 2O的溶液A加入0.2%的X-Gal；
（5）37℃染色4h或过夜；
（6）用溶液A清洗一次；
（7）在载玻片上解剖分理出所需组织，滴上100%甘油制成装片储存或拍摄。
2.1.6.6原位杂交
原位杂交（in situ hybridization）是研究发育生物学的一个重要手段，通过对不同组织或器官基因表达水平的检测，揭示基因在体内作用的分子机制。原位杂交的基本流程是：探针合成，组织或成虫盘收集、固定，预杂交，杂交，抗体（碱性磷酸酶标记的抗地高辛）孵育，显色。
（1）制备探针。将pCS2-Rho1线性化后，用地高辛（digoxigenin）标记的NTP（Roche）和T7转录酶（promega）在体外转录合成反义RNA探针；
（2）用新鲜配制的4%甲醛固定成虫盘，之后换到甲醇溶液中，-20℃环境中保存；
（3）室温下重新水化胚胎。分别用50%甲醇PBS溶液，30%甲醇PBS溶液，PBST溶液进行置换，每次5 min，4%甲醛固定胚胎20 min后，用PBST清洗2次；
（4）蛋白酶K处理胚胎。将蛋白酶K贮液按照1∶1000的比例稀释在PBST中，处理胚胎6min，PBST清洗1次，再用4%甲醛固定成虫盘20min后，用PBST清洗2次；
（5）预杂交：每管中置换成500μL HYB-溶液，60℃水浴5min；再用500μL HYB+溶液置换，60℃预杂交4h以上；
（6）杂交：用HYB+溶液将地高辛探针稀释到1ng/μL，72℃加热5min，将此探针溶液置换预杂交的HYB+溶液，60℃水浴过夜；
（7）60℃水浴洗去多余探针；
（8）杂交封闭阻断液室温处理1h，抗地高辛抗体反应液摇床4℃环境中过夜；
（9）用MABT洗去多余的抗体3次，每次25min；
（10）加入BM Purple AP底物染色。用染色缓冲液清洗2次，将成虫盘转入24孔板，加入300μL BM Purple AP底物染色液，室温避光染色，在染色达到合适的效果后，用PBST清洗2次，再用4%甲醛固定染色后的成虫盘终止染色反应，4℃环境中保存或拍摄。