2.2.2 实验方法
2.2.2.1 Ef fectene转染细胞
所有试验质粒的转染均采用Effectene转染试剂盒（QIAGEN），试验流程如下：
（1）转染前6h铺种适量S2细胞于6cm细胞培养皿中；
（2）在1.5mL离心管中用EC buffer稀释1μg DNA（终体积150μL）；
（3）加入8μL Enhancer，震荡1s后室温静置5min；
（4）加入25μL Effectene Reagent，震荡10s后室温静置10min；
（5）加入适量预热的S2细胞培养基，轻微混匀后迅速加入到细胞中；
（6）稍微摇晃培养皿，将细胞放回培养箱中。
2.2.2.2细胞免疫荧光染色实验
细胞免疫荧光染色步骤如下：
（1）转染前6 h铺种适量S2细胞于培养皿中，同时放入防脱盖玻片；
（2）用Effectene转染S2细胞，培养36h；
（3）用PBS小心清洗贴覆在盖玻片上的S2细胞2次；
（4）用新鲜配制的4%甲醛室温固定20min（小心操作）；
（5）用PBS小心清洗细胞3次；
（6）用0.2%Triton X-100封闭10min；
（7）用1%BSA室温孵育1h；
（8）在盖玻片上加上0.2 m L含有1%BSA的一抗，4℃环境中过夜；
（9）用PBS小心清洗细胞3次；
（10）加入二抗室温染色1h；
（11）用PBS小心清洗细胞3次；
（12）在载玻片上滴上包埋液，将有细胞的一面盖在包埋液上，制成装片，荧光显微镜下拍摄。
2.2.2.3免疫共沉淀实验
细胞免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）步骤如下：
（1）细胞转染36h或48h后，吹匀细胞，置入15mL离心管，1000g离心5min；
（2）弃培养基，用预冷的PBS清洗细胞2次；
（3）加入裂解缓冲液RIPA Buffer（CST）与1mmol PMSF（裂解前加入），冰上放置10min；
（4）将裂解物转至新1.5m L离心管中，4℃12000g离心10min；
（5）小心吸取10%上清，加入SDS上样缓冲液（碧云天），-20℃环境中冻存；(https://www.daowen.com)
（6）剩余90%上清，加入抗体，摇床4℃环境中过夜；
（7）加入20μL凝胶珠（Sigma），摇床4℃2h；
（8）4℃8200g离心30s收集凝胶珠，用裂解缓冲液清洗4遍，加入上样缓冲液；
（9）100℃煮5min，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2.2.2.4免疫印记实验
蛋白免疫印迹（Western blot）所用凝胶由SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天）配制，步骤如下：
（1）用胶条将长玻璃板下端封住，灌入10%分离胶至距离短玻璃板4cm，用100%乙醇封住；
（2）冷凝60min后，将乙醇倒出，吸干，灌满5%浓缩胶后立即插入梳子；
（3）冷凝45 min后，将1×电泳缓冲液倒入电泳槽，并淹没短玻璃板；
（4）取蛋白上清与5×SDS上样缓冲液混合后，100℃煮5min使蛋白变性，用微量进样器以10～20μL的量注入点样孔，在不加样槽中加入缓冲液；
（5）以浓缩胶中80V电压30min，分离胶120V 70min进行电泳（根据蛋白分子量大小适当调整电泳时间）；
（6）取下胶板，切去浓缩胶，将提前用甲醇激活的PVDF膜按“滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸”的顺序，恒流0.3A转膜1h；
（7）根据marker分子量剪裁PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭液1h；
（8）加一抗（配于1×PBST+5%牛血清），4℃环境中过夜；
（9）用1×TBST洗3遍，每次5min；
（10）加二抗（配于1×PBST+5%牛血清），室温孵育1h；
（11）用1×TBST洗3遍，每次5min；
（12）用平头镊将膜取出，吸除多余液体，置于洁净保鲜膜上，每10cm2加1m L ECL工作液（碧云天），放置1min；
（13）倒去ECL工作液，用吸水纸吸走过多的液体，用GE成像系统显影。
2.2.2.5 qRT-PCR
将新鲜解剖的果蝇翅成虫盘放入1.5 m L离心管中，用PBS清洗后，加入0.5m L Trizol，用研磨棒充分研磨，按照PureLink®RNA小提试剂盒（Ambion）中操作手册提取RNA，然后用PrimeScript TMRT Master Mix（Ta KaRa）将RNA逆转录，之后用SYBR®Premix Ex Taq TMⅡ（TaKaRa）在Stratagene MX3000P系统（Stratagene）进行定量PCR反应。
2.2.2.6双荧光素酶报告实验
将p GL3-Basic-Rho1（E1/E2/E3），copia-renilla报告质粒与p Ac5.1/V5-HisB Yki-HA表达质粒用Effectene转染法（QIAGEN）共转到S2细胞中。转染36 h后，按照Dual-Luciferase Reporter assay system提供的操作手册（Promega）进行处理后，用FlexStation 3仪器（Molecular Devices）检测荧光信号。
2.2.2.7染色体免疫共沉淀实验
染色体免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）是用于研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。用Effectene转染法（QIAGEN）将过表达Yki-HA与Sd的质粒瞬转到S2细胞中，按照Magna ChIPTMG Tissue Kit提供的操作手册（Millipore）对细胞进行相应处理，用anti-Sd、anti-HA及anti-mouse IgG抗体进行免疫沉淀，对沉淀下来的复合物进行清洗，除去非特异性结合，洗脱得到富集的靶蛋白-DNA复合物，解交联将DNA与蛋白分离，最后以浓缩的DNA为模板进行定量PCR反应。
【注释】
[1]取自网络http://www.gene-quantification.de/si-rna.html.
[2]改自网络图片http：//www.the-scientist.com/？articles.view/articleNo/34435/title/Instant-Messaging.