病毒的分离与鉴定
由于病毒具有严格的细胞内寄生性，故应根据不同的病毒选用敏感动物、鸡胚或组织细胞培养等进行病毒的分离与鉴定。但因这些方法复杂、要求严格及需时较长，故不能广泛应用于临床诊断，只用于实验室研究或流行病学调查。当有下述情况时需进行病毒的分离与鉴定：①分离病毒对诊治病人有指导性意义，尤其病程较长者；②发现第1例新的病毒或对已被消灭的病毒性疾病（如天花）怀疑“死灰复燃”时；③为鉴别临床上具有相同症状的疾病，以明确何种病毒感染；④监测所用的病毒活疫苗，及时发现恢复毒力的变异株等。
（一）病毒的分离
1.动物接种 是最原始的病毒分离方法。常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔和猴等，接种途径有鼻内、皮内、皮下、脑内、腹腔及静脉等。可根据病毒的嗜性选择敏感动物与适宜的接种部位，如嗜神经病毒可注射于小鼠脑内；柯萨奇病毒可接种于乳鼠脑内或腹腔内。接种后主要观察动物的发病情况。脑内接种一般观察2周，皮下及其他途径观察3周。当动物濒死时可取病变组织剪碎，研磨成悬液后继续传代接种。如这种传代所引起的疾患具有规律性，则显示已分离出病原病毒。该方法简便，实验结果易观察，加之某些病毒尚无敏感的细胞进行培养，因此该方法一直被沿用。但动物对许多人类病毒不敏感，或感染后症状不明显，而且动物体内常带有潜在病毒。应防止将这些潜在病毒当作真正的病原体。
2.鸡胚接种 培养孵化9～14天的鸡胚，按病毒种类接种于不同部位。
（1）接种部位（图14-1）：①绒毛尿囊膜接种用于培养天花病毒、痘苗病毒及HSV等。②尿囊腔接种用于流感病毒及腮腺炎病毒的培养等。③羊膜腔接种用于流感病毒的初次分离培养。④卵黄囊接种用于某些嗜神经病毒的培养。
许多病毒在鸡胚中不生长。因此，目前除分离流感病毒外，其他病毒的分离基本已被组织培养所取代。
图14-1 接种的部位示意图
（2）鸡胚的变化：①接种2天后，如发现鸡胚活动减弱，血管模糊不清，表示鸡胚濒临死亡，说明已被感染（如脑炎病毒）。②在接种病毒的绒毛尿囊膜上发现白色斑点，即病毒形成的痘疤见于疱疹病毒或水痘病毒。③取尿囊液或羊水，用血凝和血凝抑制试验测定病毒（流感病毒）。
3.组织培养法 组织培养或细胞培养：组织培养法是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。组织培养分为器官培养、移植培养和细胞培养。
1）器官培养：小块器官在体外培养，如气管环器官培养能保持气管的结构与功能，常用于分离较难培养的冠状病毒和鼻病毒等。
2）移植培养：也称组织培养，如用人扁桃体组织块移植培养分离腺病毒等。器官培养与移植培养现已较少应用，而细胞培养则成为病毒实验室的主要方法。
3）细胞培养：从其生长方式可分为单层培养和悬浮细胞培养。(https://www.daowen.com)
（二）病毒的鉴定
1.形态学检查
（1）电镜和免疫电镜检查：含有高浓度病毒颗粒（≥107颗粒/mL）的样品，可直接应用电镜技术进行观察。对那些不能进行组织培养或培养有困难的病毒，可用免疫电镜技术检查。即先将标本与特异抗血清混合，使病毒颗粒凝聚，这样更便于在电镜下观察，可提高病毒的检出率。IEM比EM检查更特异准确。用此法从轮状病毒感染者的粪便标本、HBV或HIV感染者的血清标本及疱疹病毒感染者的疱疹液中，均可快速检出典型的病毒颗粒，故可帮助早期诊断。
（2）普通光学显微镜检查：有些病毒在宿主细胞内增殖后，在细胞的一定部位（胞核、胞质或两者兼有）出现一个或数个、圆形或椭圆形、嗜酸性或嗜碱性的结构，即包涵体。包涵体对病毒感染的诊断有一定价值。如取可疑病犬的大脑海马回制成染色标本。发现细胞质内有内基小体便可确诊为狂犬，被咬者则需接种狂犬病疫苗。
2.检查病毒性抗原 近年来，采用标记技术，即用荧光素、放射性同位素、过氧化物酶标记抗体，检测标本中的抗原，此方法具有敏感、特异、快速等优点。
3.检测特异性抗体的快速诊断 检测病毒特异性IgM抗体可诊断急性感染，特别是IgM抗体的存在对证实孕妇感染风疹病毒尤为重要。目前IF法、固相放免法和ELISA法都已应用于IgM的检测，但应注意类风湿因子（IgM）的干扰。另外，检测早期抗原的抗体是快速诊断的另一途径。如检测针对EBV的早期抗原（EA）、核心抗原（EANA）和衣壳抗原（VCA）等的抗体，可以区别急性或慢性EBV感染。此外，分子生物学检测技术、气相色谱技术等，均可用来分析和鉴定病毒感染。
4.检测病毒核酸
（1）核酸杂交技术：双链DNA在高温及碱性溶液中，碱基对间的氢键被破坏，两链分开变成单链的过程叫变性；在中性盐溶液中，当温度慢慢冷却至室温时单链DNA又重新组合成双链的过程叫复性。核酸分子杂交技术的原理就是利用DNA可以变性、复性的特性，制成用同位素或非同位素标记的单链DNA片段基因探针，与固定在硝酸纤维素膜上待测的变性DNA杂交，再用放射自显影技术或其他显色法来确定与探针DNA同源的DNA。核酸杂交技术不仅具有特异、敏感和快速等优点，而且能定量与分型。
（2）核酸扩增法：80年代中期，美国Cetus公司首创一种DNA扩增技术——PCR，这一技术能使pg水平的核酸在短时间内达到ng水平而被检出。近年来还发展了一系列以PCR为基础的其他体外核酸扩增技术。已被广泛应用于病毒性感染的诊断与研究中。
综上所述，病毒的分离鉴定、快速诊断技术、检测病毒核酸技术及血清学试验是病毒性疾患的主要检查手段，可根据病毒与临床特点选择。