微生物发酵制药的基本流程
微生物的发酵技术一般分为上游技术、中游技术和下游技术三个阶段：上游技术是发酵生产用菌种的选育；中游技术是微生物在适宜条件下的培养过程（发酵阶段）；下游技术是从发酵培养液中分离、提取、精制加工有关产品的过程（提取阶段）。
（一）中游技术－发酵阶段
1.微生物发酵的基本流程（图39-1）。
图39-1 微生物发酵的基本流程
2.微生物发酵培养的方法 现代发酵工业上常用的培养方法有分批发酵法、连续发酵法、补料分批发酵法和固定化细胞发酵法（表39-2）。
表39-2 常见的发酵培养方法
3.发酵工艺控制 微生物发酵生产的水平最基本的是取决于生产菌种的性能，而优良菌种还需要有最佳的环境条件即发酵工艺（图39-2、图39-3）加以配合，使其处于最佳的产物合成状态，才能取得优质高产的效果。
图39-2 发酵工艺控制
图39-3 单罐连续发酵示意图
（1）无菌操作：发酵过程中发生杂菌污染影响产品生成量，因此，在移种、取样等过程中应进行严格的无菌操作。
（2）营养物质：发酵中微生物所需要的营养必须充足。因此，应定时抽取发酵液对其营养物质进行监测，及时添加或调整各种营养物质，确保微生物细胞的快速生长及代谢活动。
（3）溶解氧：氧气的供给往往是需氧深层发酵能否成功的重要限制因素。氧在培养基中的溶解度极低，培养基中溶解氧很少。生产中大多是往发酵罐内通入无菌空气并加以搅拌，来维持溶解氧水平。
（4）通气和搅拌：通气的目的是为微生物细胞提供所需要的氧。搅拌除有利于增加培养基中溶解氧的浓度、提高通气效果外，还有利于热交换，使培养液的温度一致，有利于营养物质和代谢物的分散均匀。
（5）温度：发酵过程中的温度可影响微生物的生长、产物的形成、发酵液的物理性质、生物合成的方向等，而最适发酵温度又因菌种、培养基成分和浓度、菌体生长阶段、培养条件的不同有所差异。在抗生素发酵中，选择最适发酵温度主要从两方面考虑，即微生物生长的最适温度和代谢产物合成的最适温度，因为这两个阶段所需温度往往不同，如青霉素产生菌生长的最适温度为30℃，而产生青霉素的最适温度是24.7℃。因此，实践中应结合考虑具体情况进行最适温度的选择控制。
（6）酸碱度：各种微生物都有自己生长与生物合成的最适酸碱度，有些生长繁殖阶段与产物形成阶段所需的最合适的pH值是不一致的。如链霉菌生长最适pH值为6.3～6.9，而链霉素形成的最适pH值为6.7～7.3。发酵过程中培养基的酸碱度会随多种因素的影响而发生变化，因此在发酵过程中应定时测定，并以生理酸性物质（如硫酸铵等）或生理碱性物质（如氨水等）调节pH值，以适应微生物生长和产物合成的需要。
（7）泡沫：通气、搅拌、微生物代谢等多方面因素均形成泡沫，这是发酵中的正常现象，但过多的泡沫会影响生产，如占据空间而使发酵液减少、增加杂菌污染机会、影响微生物的呼吸而使其代谢异常等。生产中常通过机械的强烈振动或加入消沫剂来除去泡沫。
（8）杂菌污染：非发酵用微生物进入发酵系统会影响发酵的正常进行。因此在发酵的进程中，要及时发现和消除杂菌污染。监测方法是在发酵的各个阶段定期从取液孔取出一定量的发酵液进行检查，发现污染及时采取相应的处理措施。
（9）发酵终点的判断：发酵过程中通过定期取样，测定产物的含量、发酵液的酸碱度、含糖量和含氮量、菌体量及菌体形态的观察等，判断合适的放罐时机。一般放罐应在产物产量的高峰期，过早或过迟都会影响产物的产量。
（二）下游加工过程－提取阶段
发酵液组成非常复杂，其中微生物细胞碎片、杂蛋白质、无机离子、代谢产物等杂质含量很高，发酵目的产物所占比例极少，大多低于10%，各种抗生素的浓度不足1%。提取阶段的主要任务就是采取适宜的方法技术，从发酵液中分离得到符合要求的发酵产品。
由于发酵生产的目的产物不同（如有的需要菌体、有的需要初级代谢产物、有的需要次级代谢产物），对产品质量的要求也有所差异，因此获取产品的方法技术不尽相同，但通常按生产过程的顺序将提取阶段分为若干个环节，即发酵液的预处理、提取、精制、成品加工等（图39-4）。
图39-4 微生物发酵阶段提取示意图
1.发酵液的预处理 无论发酵产物是在发酵液中还是在微生物细胞内，因发酵液体积大，且杂质含量高，必须进行发酵液的预处理，其目的有三：①将发酵液的固相与液相分开；②尽可能地使发酵目的产物转入以后要处理的液相中；③去除发酵液中的大部分杂质。
发酵液预处理过程包含以下基本内容：
（1）菌体分离：离心和过滤是为了将发酵液中的菌体从液相中分离出来。常用的分离方法有离心分离和过滤。对于发酵液中的细菌和酵母菌一般采用高速离心法进行分离。对于细胞体积较大的丝状菌包括霉菌和放线菌的分离则采用过滤方法。
（2）破碎细胞与细胞碎片的分离：细胞破碎常用高压匀浆法和研磨法等。细胞碎片的分离方法常采用离心分离法。(https://www.daowen.com)
（3）去除蛋白质：目的是去除发酵产品以外的可溶性蛋白质，常用方法有等电点法或加热法。
（4）调整发酵液的酸碱度和温度：一方面通过调整发酵液的酸碱度和温度，尽可能地使发酵产物转入便于以后处理的相中（多数是液相）；另一方面尽量避免因温度及酸碱度过高或过低引起发酵产物的破坏或损失，保证发酵产物的质量。
（5）除去金属离子、热原质等有机杂质：发酵液中存在重金属离子、色素、热原质和毒性物质，直接影响发酵产物的质量和收获率，也影响发酵产物的提取和精制，一定要予以去除。
2.发酵产物的提取（初步纯化） 发酵产物的提取方法很多，归纳起来有以下几种（表39-3）。
表39-3 发酵产物的常用提取方法
3.发酵产物的精制（高度纯化） 生产实践中，通常采用层析法来分离和精制浓度比较低的产物。常用的层析技术有吸附层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析法等（表39-4）。
表39-4 发酵产物的常用纯化方法
以上各提纯、精制方法，还有蒸馏分离法（对液体混合物分离或从溶液中回收某些溶剂的方法）、膜分离法（物质透过或被截留于膜的“筛分离”方法），均可在提纯、精制过程中使用，实际工作中，常需根据目标产物的特性来选用不同的合适方法，并需多次分离、提纯，最终达到精制目的。
4.成品加工 根据产品应用要求，利用浓缩、结晶、干燥（表39-5、表39-6、表39-7）等技术对已纯化的产物作最后加工处理，以获得符合质量要求的产品。浓缩的目的是将低浓度的溶液除去一定量的溶剂变成高浓度的溶液；结晶可使溶质从溶液中析出呈晶体状态；干燥的目的是除去发酵产品中的水分。
表39-5 常用的浓缩方法
表39-6 常用的结晶方法
表39-7 常用的干燥的方法
加工完成后的产品，应进行有关产品的纯度、稳定性和活性等方面的检测，以确保产品的质量。通常需从下列两个方面进行检验（表39-8）。
表39-8 常见的成品检验项目和内容
发酵产物经过上述分离、提取和精制的各个过程，经检验达到规定的纯度、含量等标准，然后进行分装。根据不同的发酵产物的性质、特点，采用不同的容器将产品分装成便于储藏和运输的形式。