5.2.6 小RNA测序
小RNA（miRNA，siRNA，piRNA等）是生命活动的重要调节因子，并且在生理过程中起重要作用，如基因表达的调节、生物的发育、代谢和疾病。目前，人们能够对细胞或组织中的所有小RNA进行深度测序和定量分析。在该实验中，首先从总RNA中分离出18～30 nt范围内的小RNA，并将特异性末端添加到两端，然后在体外进行逆转录以制备cDNA并进一步加工，然后通过测序仪单向终止DNA片段，直接测序。通过对小RNA的大规模测序分析，可以获得该物种的全基因组miRNA图谱，包括新miRNA分子的挖掘、靶基因的预测和鉴定、样品之间的差异表达分析及miRNA聚类、表达剖析等科学应用。
（1）小RNA测序样品要求
①样品纯度要求：OD值应在1.8～2.2之间；电泳检测28S∶18S至少大于1.5。
②样品浓度：总RNA浓度不低于750 ng／μg；样品总量（小RNA∶总RNA大于0.3%）不低于40μg。或提供浓度大于2 ng／μg，小RNA样品总量大于180 ng。
③小RNA样品置于－20℃保存；请提供小RNA样品具体浓度、体积、制备时间、溶剂名称及物种来源。如需进行多次样品制备，需要提供重复制备所需的样品。
④样品运输：请将样品置于1.5 mL离心管中，注明样品名称、浓度及制备时间于管上，管口使用Parafilm封口。建议采用干冰运输，并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的可能性。
（2）小RNA分离的方法
现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提＋乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅胶膜离心柱的方法来纯化RNA。由于硅胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA（200 nt以上），小RNA往往被淘汰掉，因而不适用于小RNA的分离纯化。有机溶剂抽提能够较好地保留小RNA，但是后继的沉淀步骤比较费时费力。
（3）小RNA测序文库的构建方法及质量控制
由于Solexa的读长足够满足小RNA测序的读长要求，数据读取量大，性价比高，因此Solexa在小RNA测序方面得到广泛的应用。采用Solexa进行小RNA测序其文库构建方法如下：
①PAGE胶纯化特定大小的小RNA分子；
②5′接头连接和纯化；
③3′接头连接和纯化；
④RT-PCR扩增；(https://www.daowen.com)
⑤小RNA文库的纯化；
⑥文库的检测：小RNA文库需要通过电泳检测和Agilent Technoligies 2100分析仪对测序文库中片段的大小、纯度和浓度进行分析。
（4）高通量测序研究小RNA优势
目前研究小RNA的方法主要是通过实时定量PCR和基因芯片技术。这些方法集中于miRNA的表达和定量，并且仅限于已知其序列信息或次级茎环结构的RNA的研究，发现新的小RNA分子。基于高通量测序技术的小RNA测序技术突破了当前研究技术的局限，使研究人员能够直接对样品中的小RNA进行高通量测序。主要优点是：
①小RNA分子可以在核苷酸水平上直接研究，没有传统芯片杂交的荧光模拟信号引起的交叉反应和背景噪声问题，这对于区分同一家族的不同小RNA分子和类似的序列是非常有利的。
②无任何先前序列信息和二级结构信息的可以对任何物种进行高通量分析。
③高灵敏度和大的测序通量为小RNA分子的发现和研究提供了巨大的数据深度和覆盖率，并且可以检测极低丰度的稀有转录。
④通过测序产生的原始数据可以与各种分析软件兼容，可以注释小RNA的基因组信息，并分析其表达水平。它可以使用公共的小RNA数据库随时注释已知的小RNA，并可以进一步分析不匹配的数据，发现新的小RNA种类和异构体，以进行更深入的研究。
（5）小RNA测序的影响因素
①样品的质量：在小RNA测序过程中，需要分离小RNA。分离的小RNA的质量和纯度直接影响测序结果。由于RNA易被降解，必须严格按照实验要求进行RNA提取、纯化等操作，以确保样品的质量。
②构建文库的质量：文库构建需要PAGE凝胶分离和纯化小RNA，然后纯化接头用于RT-PCR。在此过程中，必须注意确保小RNA不会降解，并且纯化过程必须确保去除接头，残留接头将对后续测序产生影响。
③测序文库的上样量控制：该因素也将极大地影响聚类形成的密度。由于上样量非常小，仅为1～8 pg，微量样品的准确定量已成为影响测序通量的重要因素。