5.2.9 实时定量PCR
实时定量PCR（Real-Time Quantitative PCR）是指通过在PCR指数扩增期间连续监测荧光信号强度的变化来瞬时确定特定产物的量，并且在不取出PCR产物的情况下从中推断出靶基因的初始量。
荧光定量PCR实时监测DNA结合荧光染料激发的荧光；普通PCR通过检测插入DNA中的核酸染料的量来确定PCR终产物的量，通常采用的是紫外光。荧光定量对扩增片段有很高的要求，通常为100～300 bp；普通定量可以扩增的是长片段。如果不需要检测产物的分子量，可以在不进行电泳的情况下定量分析荧光而定量，而普通PCR必须进行电泳。荧光定量可以实现准确的定量，但普通PCR不能。荧光定量分析可以看到整个扩增过程，可以看到扩增效率、溶解温度、直接获得的标准曲线等，而这是普通PCR无法实现的。
实时定量PCR可应用于以下领域：医学、农业、畜牧业和生物相关分子生物学的定量研究；诊断和评估传染病，如肝炎、艾滋病、禽流感、肺结核和性传播疾病；地中海贫血和血友病、性别异常、智力低下综合征、胎儿畸形和其他产前和产后检查；肿瘤标志物和肿瘤基因检测，以实现肿瘤诊断；基因检测实现遗传病诊断、禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门氏菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等；食物来源微生物、食物过敏原、转基因、乳酸菌等肠杆菌。
（1）定量PCR的理论依据
特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。理想的扩增结果是：Y＝X×2n。其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体中的原始模板数，n为扩增次数；理论上PCR扩增效率为100%，PCR产物随着循环的进行呈指数增长，但实际上DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中模板不是乘2的倍增长。实际应为：Y＝X（1＋E）n。其中E代表扩增效率，E＝参与复制的模板／总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X在1～105拷贝、循环次数n≤30时，E相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n的增加（＞30次），E值逐渐减少，Y呈非固定的指数形式增加，最后进入平稳期。
（2）定量PCR的分类
根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为四种方法：
①有限稀释法，也称为倍比稀释法。通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止，来设置已知浓度的参照品；根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数；利用最大稀释度来进行标本核酸定量时的注意点：a.PCR产物的最低可检测极限须有重复性；b.对每个稀释度必须做多次PCR，一般先对模板DNA做10倍连续稀释后做PCR，接下来找到PCR结果呈阴性的最近稀释点，然后再对各稀释度做系列的2倍稀释，每个稀释点做5次PCR；c.必须严格控制污染。此法的优点是：不需要特殊设备；缺点是：扩增反应条件的标准化，严格注意污染，避免假阳性的产生。
②使用外参照物的定量PCR，以已知浓度的目的基因为模板，按一定的倍比稀释，然后做出标准曲线图，未知的标本按着标准曲线找出对应的拷贝数。荧光定量PCR通常使用该法做标准曲线。
③使用非竞争性内参照物的定量。PCR反应条件同样，在同一试管内，用两对引物，同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标序列，通过比较两种序列的扩增产量可对靶序列定量。
④使用竞争性内参照物的定量PCR。同样的反应条件，同一个试管，用同一对引物，同步扩增靶序列和内参照序列。靶基因的量可通过与产生相同产物的竞争物的量相比较而得到。其基本条件是靶序列和竞争序列均用相同的引物以相同的效率扩增，两序列的初始化比值在整个反应过程中保持不变。目的DNA内参照DNA变性（同一对引物）PCR竞争性模板的设置：通过改变克隆的靶基因的序列来设计竞争性模板插入新的限制性酶切位点或使原来的酶切位点缺失，通过基因重组技术插入一个与特异性蛋白结合的DNA片段，或者使靶序列发生定点诱变人工合成竞争性模板。竞争性模板设计目的是：使其与靶基因的PCR扩增产物相区别（通过酶切、杂交、显色等手段实现）。
根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类及最后检测的信号的不同可分为四种类型：a.直接定量检测法；b.同位素标记定量检测法；c.酶标记定量检测法；d.荧光定量PCR技术。(https://www.daowen.com)
荧光定量PCR主要原理是：荧光共振能量转移，外来光源激发供体荧光染料发出荧光，当其发射波长与受体荧光染料的吸收波长部分重叠，且两者距离很近（10～100埃）时，受体荧光染料吸收供体荧光传递的能量而激发出另一波长的荧光，同时将供体荧光淬灭。
依据PCR过程的监测检测模式又可分为如下几种：
①SYBR Green I检测模式
SYBR Green I是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料，其与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I的最大吸收波长约为497 nm，发射波长最大约为520 nm。PCR扩增程序一般为94℃—55℃—72℃三步法，40个循环。
SYBR Green I的缺点是：由于SYBR Green I没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。
SYBR Green I的优点是：由于它能同所有的双链DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。
②水解探针模式（TaqMan）
TaqMan探针是一种寡核苷酸探针。荧光基团连接在探针的5′端，而淬灭剂则在3′端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3′端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5′端外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此TaqMan探针检测的是积累荧光。PCR扩增程序通常是：94℃—60℃，40个循环。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。
③杂交探针模式（Beacon，FRET）
分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中，环一般为15—30个核苷酸，并与目标序列互补；茎一般为5—7个核苷酸，并相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团是FAM，Texas Red。PCR扩增程序通常是：94℃—55℃—72℃三步法，40个循环。FRET探针又称双杂交探针。FRET探针由两条相邻探针组成，在一条探针的5′端标记FAM荧光基团，另一探针的3′端标记Red 640荧光基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM基团和Red640基团相邻，激发FAM产生的荧光，作为Red640基团的激发光被吸收，使Red640发出波长为640 nm的荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640 nm波长的荧光。