5.2.7 PCR技术
PCR（Polymerase Chain Reaction）技术，即聚合酶链式反应，又称DNA体外扩增技术，是美国PE-Cetus公司人类遗传研究室科学家K.B.Mu llis于1983年发明的一种在体外快速扩增目的基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万倍，乃至千万倍，而可以获得足够数量的准确DNA拷贝且无须烦琐且耗时的基因克隆程序，因此一些人称之为无细胞分子克隆。该技术操作简单，易于掌握且可靠。它为基因分析和研究提供了强有力的手段。它对整个生命科学现代分子生物学研究的开创性工作具有深远的影响。现在，PCR技术不仅可以用来扩增与分离目的基因，而且在临床医学诊断、胎儿的性别鉴定、癌症治疗的监控、基因突变与检测、分子进化研究、法医学等诸多领域都有着重要的用途。因此，该技术出现之后，被《科学》杂志评为1989年十大科技新闻之一，荣获1993年度诺贝尔化学奖。
（1）PCR技术的基本原理及特点
PCR技术快速敏感，简单易行，其原理并不复杂，与细胞内发生的DNA复制过程十分类似。首先是双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板，并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新的DNA互补链。此外，DNA聚合酶同样需要有一小段双链DNA来启动（“引导”）新链的合成。因此，新合成的DNA链的起点事实上是由加入反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点决定的。这是PCR的第一个特点，即它能够指导特定DNA序列的合成。
在为每条模板链提供一条寡核苷酸引物的情况下，两条单链DNA都可以作为合成新生互补链的模板。由于PCR反应中选择的引物对是根据扩增片段两端的序列彼此互补的原则设计的，因此每个新生链的合成始于引物的退火结合位点并沿着链条的方向前进。因此，在每个新合成的DNA链上存在新的引物结合位点。然后再次加热反应混合物以分离新旧链和下一轮反应循环，引物杂交，DNA合成后与链分离。PCR反应的最终结果是：在几个循环后，反应混合物中含有的双链DNA分子的数量，即两个引物结合位点之间的DNA片段的拷贝数，理论最大值应为2n。PCR反应需经历重复的温度循环，每个温度循环由三个阶段组成：高温变性、低温退火和中等温度延伸。
（2）PCR反应体系的组成与反应条件
①反应缓冲液（10×PCR Bu ffer）
一般随Taq DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50 mMKCl，10 mM Tris-HCl（pH＝8.3室温），1.5 mMMgCl2。Mg2＋的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2＋为1.5 mM较合适。若样品中含EDTA或其他螯合物，可适当增加Mg2＋的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2＋的浓度。据经验，一般以1.5～2 mM（终浓度）较好。
②耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）
在早期进行的PCR反应中，使用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段，但这种酶是热敏感的，在DNA双链变性解链时会被高温降解掉。因此，在每一个循环反应中，都需要通过人工操作不断地补充新鲜的聚合酶。这样的实验过程不仅费时乏味而且浪费金钱。直到1988年，R.K.SaiKi等人成功地将热稳定的Taq DNA聚合酶应用于PCR扩增，提高了反应的特异性和敏感性，从此PCR技术开始走向了实用化。Taq DNA聚合酶最初是由H.A.Erlich于1986年从一种生活在温度高达75℃的热泉中的细菌，即栖热水生菌中分离纯化出来的。在补加有四种脱氧核苷三磷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）的反应体系中，Taq酶能以高温变性的靶DNA分离出来的单链DNA为模板，以结合在扩增区域两端的引物为起点，按5′→3′的方向合成新生互补链DNA。这种DNA聚合酶具有耐高温的特性，且在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA的合成能力，一次加酶即可以满足PCR反应全过程的需求。
实验室常用DNA聚合酶有三种：TaqTM，EXTaqTM和PyrobbestTM DNA聚合酶。TaqTM聚合酶是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价格便宜，一般用于基因表达的检测等。EXTaqTM是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3′端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobbestTM DNA聚合酶也是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。在50μL反应体系中，一般加入1～2 U的酶量，足以达到每1 min延伸1 000—4 000个核苷酸的掺入速度。如加入的酶量过多，将导致产生非特异性产物。
③脱氧核苷酸（dNTP）
DNA的基本组成元件包括dATP，dGTP，dCTP，dTTP。高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能导致不能扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用浓度为50～400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其他几种（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2＋结合，使游离的Mg2＋浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2＋浓度。
④寡核苷酸引物（Primer-F，Primer-R）
PCR扩增引物是指与待扩增的靶DNA区段两端的序列互补的合成寡核苷酸短片段，长度通常为15—30个核苷酸。引物是确定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中非常重要。为了确保PCR反应能够准确、特异和有效地扩增模板DNA，通常引物设计应遵循以下原则：引物长度为15—30 bp，一般（G＋C）含量为45%～55%，Tm值高于55℃；引物的3′末端不应与引物内部互补，避免在引物内部形成二级结构，两个引物在3′末端也不应具有同源性，以避免引物二聚体的形成。
⑤靶序列（DNA模板）
PCR需要较少的模板，单链和双链DNA可用作PCR的样品。尽管PCR可以使用极少量的样品（甚至来自单个细胞的DNA）作为模板，但为了确保反应的特异性，通常优选使用μg水平的基因组DNA或104个拷贝的片段来被放大作为起始材料。原料可以是粗制的，即使用溶剂一步提取后一些物质也可用于扩增，但存在蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂和DNA结合蛋白混合可能会干扰PCR反应。